Liposome에 삽입한 간장암 세포 항체와 항암제의 항암효과에 관한 연구

Abstract

[한글]

인체에서 발생하는 대부분의 종양은 화학요법, 방사선요법, 면역학적 요법, 외과적 절제등 여러 방법으로 치료되고 있지만, 이 방법들이 모두 암세포에 특이한 것은 아니다. 특히 진행된 암을 치료하는 방법으로 화학요법이나 방사선 요법이 많이 이용되고 있으나 이 방법들은 암 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 독성을 미친다는 것이 가장 큰 문제점으로 지적되고 있다. 이에 본인은 3'-Me DAB으로 백서에서 간장암을 유발시킨 다음 간장암 세포 원형질막 표면에 나타나는 종양 특이 항원을 정제분리한 것을 가지고(Kim등, 1985)

토끼에 주사하여 항체를 합성시킨 다음 affinity chromatography 법을 이용하여 항체를 부분 분리한 후 인공 생물막인 liposome에 항체와 methotrexate를 삽입시켜 대조군, 간장 재생 진행군 및 3'-Me DAB으로 유도한 간장암을 가진 백서의 꼬리 정맥에 투여하여 이 약물이 간장암 세포에서 선택적으로 DNA합성을 억제 시키는지를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 현재까지 사용되고 있는 대표적인 liposome제조법인 세척제 투석 (detergent dialysis)법, sonication방법, reverse phase evaporation vesicle(REV)법을 이용하여 1.25mg의 methotrexate를 가지고 liposome내로 포획시켜 본 결과, lecithin과 cholesterol의 농도가 각각 1.9/1.Omg(mol비 1:1)인 상태에서 세척제 투석법, sonication법 , REV법은 각각 0.013±0.007%, 0.064±0.012%, 3.2±0.2%이었으며, lecithin과 cholesterol의 농도를 각각 3.8/1.9mg(mol비 1:1)으로 2배 증가시켰을 때 세척제 투석법, sonication법, REV법은 각각 0.030±0.010%, 0.184±0.09%, 8.0±1.2%로서 방법에 따라 다소 차이는 있으나 세척제 투석법에서 2.3배, sonication 법에서 2.8배, REV법에서 2.5배 증가하였다. Liposome에 포획되는 methotrexate양은 lecithin과 cholesterol농도가 1.9/1.Omg인 경우 세척제 투석법에 비해 sonication법은 4.9배, REV법은 246배 많았다.

2. REV법으로 liposome을 제조할 때 넣어준 전체 지질의 농도가 methotrexate의 미치는 영향을 알아보기 위해 전체 지질의 농도를 2.5,5,7,5,10 ㎛mo1로 고정하고, methotrexate가 liposome내로 포획된 양을 정량한 결과 각각 1.9, 3.2, 5.6, 8.0%로 전체 지질의 농도와 methotrexate의 포획량 간에는 비례 상관 관계가 있었다(Y=0.8X-0.5, r=0.99), 즉, 지질농도증가에 따라 liposome내에 포획되는 methotrexate의 양이 증가하였다.

3. 대조군, 간장 재생 진행군 및 간장암군에 **3H-thymidine을 한 마리당 10μCi씩 주사한 후각군의 백서에 dihydrofolate reductase의 활성을 경쟁적으로 억제하여 DNA합성을 억제한다고 알려진 methotrexate를 투여하지 아니하거나, methotrexate단독, liposome에

methotrexate를 포획시키거나 또는 liposome에 methotrexate와 간장암 세포 표면 종양 특이 단백질에 대한 항체를 동시에 포획시킨 다음 투여하고 DNA합성속도를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

Methotrexate를 투여하지 않은 각군의 백서에서 간장내 DNA합성 속도는 대조군에서 1,493±722 DPM/mg DNA이었고 재생 진행중인 간장에서는 15,865±2,340 DPM/mg DNA로서 대조군에 비해 10.6배 빠르고, 간장암의 경우는 육안적으로 세포변형 (transformation)이 일

어나지 않았다고 생각되는 부분(smooth area)에서 3,664±504 DPM/mg DNA로 2.5배, 육안적으로 결절(nodular area)이 관찰되는 부분에서는 8,029±504 DPM/mg DNA로 5.4배 빨랐다. 이런결과로 DNA합성 속도는 간장의 재생이 진행중일때 가장 빠르고, 간장암에서는 결절이 있는 부위가 없는 부위에 비해 2.2배 이상 바르나 재생 진행중인 간장에 비해 DNA합성 속도는 약 1/2정도로 나타났다. 이런 사실은 간장암은 서서히 진행된다는 것을 의미하고 육안적인 형태변화가 뚜렷한 결절 부위에서 DNA합성이 활발하다는 것을 시사한다. 대조군의 백서를 methotrexate를 투여하지 않은 군, methotrexate단독 투여군, methotrexate를 liposome에 포획시켜 투여한 군, 종양 특이 항원에 대한 항체와 methotrexate를 liposome에 동시에 포획시켜 투여한 군으로 나누어 DNA합성 속도를 비교한 결과 각 군에서 DNA합성속도는 차이가 없었다. 이는 정상 대조군에서는 DNA합성이 별로 일어나지 않기 때문에 methotrexate를 어떤 형태로 투여하여도 세포내에서 DNA합성 억제가 별로 일어나지 않는 것으로 생각된다. 각군의 백서에서 methotrexate를 투여하지 않은 경우의 DNA합성 속도를 methotrexate단독 투여군, liposome에 methotrexate를 포획시킨 군, 항체와 methotrexate를 liposome에 동시에 포획시킨 군의 DNA합성 속도에서 뺀 후 methotrexate단독 투여군의 차이를 다른 군의 차이와 나누어 변화율을 계산해 본 결과 재생 진행 간장, 간장암 조직의 smooth area, 결절 부위에서 liposome에 methotrexate를 포획시킨 군과의 변화율은 각각 1.7, 1.6, 1.4로 별 차이가 없었으나 liposome에 항체와 methotrexate를 동시에 포획시켜 투여한 군과의 비는 1.5, 1.5, 3. 1로서 간장암 결절 부위에서의 변화율이 타군에 비행 2.2배 높았다. 이러한 사실은 methotrexate가 간장 세포로 운반될 때 liposome이 효과적인 운반체 역할을 한다는 사실을 시사하며 간장 세포의 원형질막 표면에 종양 특이 항원이 존재할 때 liposome에 이 항원에 대한 항체를 삽입시키면 간장암 세포 표면에 표현된 항원과 상호작용하여 선택적인 methotrexate의 운반이 일어난다는 결론을 뒷받침한다.

[영문]

In an attempt to investigate the role of purified antibody against partially purified 3'-Me DAB induced hepatioma specific surface antigens of plasma membrane(Kim et al., 1985) by immunoaffinity chromatography in the selective transfer of methotrexate(MTX), rats were divided into control, regenerating and hepatoma group and measured the degree of inhibition of DNA synthesis by various preparations of MTX and obtained following results.

1. The percent encapsulation of MTX in liposome preparations by detergent dialysis, sonication and REV method at lecithin/cholester concentration of 1.9/1.0 mg(molar ratio 1:1) was 0.013±0.007%, 0.064±0.012%, and 3.2±0.2%, respectively.

With two folds increase in lipid concentration in liposome preparations, the percent encapsulation by detergent dialysis, sonication and REV method was increase 2.3, 2.8 and 2.5 folds, respectively.

The amount of encapsulated MTX in liposome by sonication and REV method was 4.9 and 246 folds higher than that of detergent dialysis method.

2. By varying the total lipid concentrations(2.5,5,7,5,10 ㎛mo1) used for liposome preparation in REV method, the percent encapsulations were 1.9, 3.2, 5.6 and 8.0%, respectively.

3. The specific activities of DNA synthesis in control, regenerating liver, nodular and smooth area of hepatoma group were 1,493±722, 15,865±2,340, 8,029±504 and 3,664±504 DPM/mg DNA, respectively and the rates of DNA synthesis were 10., 5.4, 2.5 folds faster in regenerating liver, nodular and smooth area of hepatoma as compared to those of control group. DNA synthesis in regenerating liver, nodular and smooth area of hepatoma was decreased by MTX alone to 3,986, 1,565 and 1,294 DPM/mg DNA, respectively. Similarly in reconstituted MTX in liposome, DNA synthesis in regenerating liver, nodular and smooth area of hepatoma was decreased to 6,981, 2,160 and 2,090 DPM/mg DNA, respectively and the ratios of change between the inhibition of DNA synthesis by MTX and reconstituted MTX were 1.7, 1.6 and 1.4 in regenerating liver, smooth and nodular area of hepatoma.

However, in reconstituted MTX bearing antibody against hepatoma specific plasma membrane surface antigen, DNA synthesis in regenerating liver, nodular and smooth area of hepatoma was 6,106, 4,899 and 1,950 DPM/mg DNA, respectively and the ratios of change between the inhibition of DNA synthesis by MTX and reconstituted MTX bearing antibody were 1.5, 1.5, 3.1 and the ratio of change in nodular area of hepatoma was 2.2 folds higher in reconstituted MTX bearing antibody group as compared to reconstituted MTX group. These results indicate that less inhibition of DNA synthesis in smooth area of hepatioma same as regenerating liver might be due to few if any antigens are expressed. But, significant inhibition of DNA synthesis in nodular area of hepatoma suggests that tumor specific antibody inserted into liposome membranes would be recognized by surface antigens which were expressed on the plasma surface membrane of hepatoma and thereby leading to inhibition of DNA synthesis by selective internalization of drugs into hepatic cells.