Euglobulin 침전 및 protein-A affinity column을 이용한 Clq의 순수분리 및 그 성상에 관한 연구

Abstract

[한글]

Clq는 혈중 보체인 Cl의 일부로서 IgG와 IgM에 대한 수용체를 가지고 있어 항원-항체의 면역복합체가 형성되면 전형적 경로를 통한 보체 활성화를 일으키는 중요한 단백질이다.

본 연구는 구하기에 손쉬운 인혈청 (human serum)을 이용하여 기능적으로 활성이 있으며 IgG가 검출되지 않는 순수한 Clq를 손쉽게 분리하는 방법을 개발하고, 이 방법을 이용하여 Clq를 순수 분리한 후, Clq의 소단위 (subunit)와 aggregated human gamma-globulin (

AHGG), 혈중 면역복합체 및 단분자 IgG와의 결합능을 조사하고자 다음과 같은 실험을 하였다.

인혈청으로 부터 Clq의 분리는 두차례에 걸쳐 EDTA가 포함된 저 이 온 강도 (low ionic strenth)의 용액에서 침전시켜 회수하였고, protein-A affinity chromatography로 IgG를 제거시키도록 하였다. 분리된 Clq의 순도는 Ouchterlony double immunodiffusion과 sodi

um dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 검정하였고, Clq의 소단위 는 SDS-PAGE로 관찰하였다. Clq의 각 소단위에서의 생물학적 결합능을 관찰하기 위하여, SDS-PAGE로 전기영동된 Clq를 nitrocellulose membrane에 전이시키고 AHGG, 혈중 면역복합체치가 높은 환자의 혈청 및 단분자 IgG등과 반응시킨후 immunoperoxidase염색을 하여 반응띠를 관찰하였다. 분리된 Clq를 이용하여 전신성 흥반성낭창 및 류마토이드관절염 환자와 정상인에서의 혈중 면역복합체의 양을Clq ELISA법을 이용하여 구하였

다. 상기 실험으로 얻어진 결과는 다음과 같다.

1. 저이온강도에서의 euglobulin침전 및 protein-A affinity chromatography를 이용하여 인혈청으로부터 순수한 Clq를 18.3% 회수할 수 있었다. IgG는 1.2 mg/dl이하였고 최종적으로 618배의 specific activity의 증가를 보여주었다.

2. Clq는 2개의 비공유결합 소단위로서 55KD과 45KD의 분자량을 가지고 있었고, 공유결합 소단위는 30, 28및 22KD의 분자량을 가지고 있었다.

3. Clq의 분자량은 Sepharose-6B gel permeation chromatography 상에서 440 KD으로 추산하였다.

4. Westernblotting에서, Clq는 55, 30 및 28KD의 소단위에서 강한 항원성을 보여주었다. AHGG와의 결합능은 55KD및 30KD의 소단위에서 관찰되었다. 한편 Clq와 AH7G와의 결합반응과 유사한 반응띠가 단분자 IgG, 높은 헐중면역 복합체치를 보였던 전신성 흥반성낭창환자의 혈청및 정상인의 혈청과도 30KD의 소단위에서 관찰되었다. 또한 Clq를 열처리차여 비동화시켜도 AHGG와의 결합능은 소실되진 않았다.

5. 혈중 면역복합체 측정을 위한 Clq ELISA 실험에서, plate에 Clq를 도포(coating)시키기 전에 열처리하여 비동화시킨 결과 AHGG와의 결합능이 소실되었음을 알 수 있었다.

6. 전신성 흥반성낭창을 포함하는 결체조직 질환에서의 혈중 면역복합체 측정에 분리된 Clq가 효과적으로 이용될 수 있었다.

이상의 결과로 저이온 강도에서의 euglobulin침전 및 protein-A affinity column을 이용하여 순수하고 생물학적 활성이 있는 Clq를 효과적으로 분리할 수 있었다. Clq와 AHGG와의 생물학적 결합능은 Clq가 변형되지 않은 상태로 존재해야 하나 열처리 혹은 화학처리를 하여 비동화시켜도 개개의 fibril내의 IgG에 대한 결합능은 유지되고 있음을 알 수 있었다. 향후 분리한 Clq를 각종 생화학적 실험에 사용할 수 있고, 임상적으로 혈중 면역복합체 측정에 사용하여 각종 자가면역성 질환의 병태생리 구명에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]

Clq is an important component of the complement system as it provides the binding site for certain classes of IgG and IgM and can trigger the complement activation cascade following antigen-antibody immune complex formation. The present study was

carried out in order to develop an alternative method for the isolation of human Clq which utilizes human sera and gives functionally active Clq with no detectable IgG contamination. The study also explored the binding activity of each subunit of Clq with aggregated human gamma-globulin, circulating immune complexes and monomeric IgG.

Human serum was treated for two successive euglobulin precipitation steps at low ionic strength in the presence of EDTA and one affinity chromatographic clarification of IgG using protein-A. The purity and subunit structure of isolated Clq was assessed by Ouchterlony double immunodiffusion and sodium dodecyl

sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After SDS-PAGE, Clq was transferred to a nitrocellulose membrane and reacted with aggregated human gamma-globulin, serum with high level circulating immune complexes or monomeric IgG followed by immunoperoxidase staining. Using isolated Clq, Clq ELISA for the

detection of circulating immune complexes was performed in sera from patients with systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis and normal controls.

The results obtained were as follows:

1. Clq was purified to homogeneity from human serum by euglobulin preciptation and protein-A affinty chromatography. Overall yield of Clq was 18.3% with IgG less than 1.2 mg/dl. The final product had a 618-fold increase in specific activity of

Clq.

2. In SDS·PAGE at nonreducting conditions, the purified Clq showed bands at 55 and 45 KD whereas at reducing conditions, bands at 30, 28 and 20 KD were found.

3. In Sepharose-6B gel permeation chromatography, the molecular weight of native Clq was 440 KD.

4. In western blotting analysis, the submits of 55, 30 and 28 KD reacted with anti-Clq indicating the antigenicity. However, only subunits of 55 and 30 KD were able to react with aggregated human gamma-globulin thus showing the binding activity of the subunits. Similar binding activities were also found with 75-IgG,

high immune complex sera of SLE patients and normal control sera in the 30 KD subunit. Even after heat inactivation, Clq still showed binding activity with aggregated human gamma-globulin.

5. In Clq ELISA for the detection of circulating immune complexes, heat inactivation of Clq before coating the plate resulted in the loss of binding activity with aggregated human gamma-globulin.

6. Purified Clq could be used in detecting circulating immune complexes in patients with collagen vascular disorders including SLE.

In conclusion, Clq could be purified effectively by euglobulin precipitation at low ionic strength and protein-A affinity chromatography. Intact molecular structure of Clq was essential for binding activity with aggregated human gamma-globulin but the binding activity of Clq with monomeric IgG remained even after chemical or heat denaturation. Purified Clq in this study can be thus used in further biochemical studies and in detecting circulating immune complexes in patients with collagen vascular disorders.