Dot-immunobinding assay에 의한 알레르겐 특이 IgE의 정량적 측정에 관한 연구

Abstract

[한글]

IgE가 제1형 과민반응에 관여하는 면역글로부린이라고 밟혀진 후, 혈청내 IgE의 측정이 알레르기 질환의 선별법으로 이용되고 있다.

알레르기 질환의 원인 알레르겐 규명을 위해서, 검사실 검사법으로 혈청내에 존재하는 알레르겐 특이 IgE의 검출이 임상에 이용되고 있으며, 또 혈청내의 알레르겐 특이 IgE의 정량적인 측정이 면역치료의 경과 관찰등에 이용하기 위하여 시도되고 있다.

현재 주로 사용하고 있는 radioallergosorbent test에 의한 알레르겐 특이 IgE의 측정은 활성화된 paper disc에 알레르겐을 결합시켜서 solid phase로 이용하는 면역측정법이다. 이 방법은 paper disc에 결합되는 알레르겐의 양을 정확하게 알 수 없고, 또 disc에 결합시킬 수 있는 알레르겐도 한정되어 있으며, 측정치가 반정량적 이라는 점과 혈청내 고농도의 IgE와 차단항체(IgG)존재시에 영향을 받는 점등의 여러가지 결함이 있어 개선책이 요구되고 있다.

알레르겐 특이 IgE의 정량을 위해서 quantitative solid phase radioimmunoassay, radioallergosorbent test elution technique과 immunoadsorption method등이 소개되어 있지만 이 방법들은 복잡하여 특별한 연구실에서만 시행되고 있는 실정이다.

Nitrocellulose filter paper는 특별한 전처치 없이도 단백질 흡착이 가능하여 단백질 전기영동에 이용되었으며 이 성질을 응용한 여러 면역측정법이 개발되었다. 최근에 사람 IgE에 대한항체를 nitrocellulose filter paper에 흡착시켜 혈청내에 미량으로 존재하는

IgE를 측정한 면역측정법이 보고된바 있다.

저자등은 혈청단백질 보다 분자량이 훨씬 적은 알레르겐도 nitrocellulose filter paper에 흡착되어 알레르겐 특이 IgE의 측정을 위한 알레르겐 dot-immunobinding assay의 solid phase로 이용할 수 있느냐 하는 점을 검토하고 또 이 방법에 의거하여 혈청내 알레르겐 특이 IgE를 정량적으로 측정 할 목적으로 본 연구를 시행하였다.

큰조아재비 (timothy)와 오리새 (dactylus) 꽃가루 알레르겐을 tris-buffered saline(pH7.4)에 용해시켜 nitrocellulose filter paper 위에 점적시키고 건조시 킨후 이 것 을 solid phase로, horseradish peroxidase를 결합시킨 monoclonal anti-IgE antibody(BS^^17

)을 검출항체로 사용하여 allergen dot immunobinding assay를 실시하였으며, solid please dactylus와 결합한 오리새 특이 IgE를 세가지 election용액으로 유리시켜 얻은 세가지 eluates내에 함유된, 생물학적으로 정상적인 오리새 특이 IgE를 가장 많이 함유한 equate를 결정하였고, 이 eluate를 표준용액으로 하여 86명의 환자 혈청 중의 오리새 특이 IgE의 정량을, 오리새에 대한 allergen dot-immunobinding assay법으로 시도하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. Nitrocellulose filter paper를 solid phase로 이 용한 allergen dot assay가 가능하였다.

2. Nitrocellulose filter paper를 알레르겐의 solid phase로 이용하기 위해서는 알레르겐마다 적정 점적농도를 결정하여야하며, 동일 알레르겐도 제조원, 조제시기에 따라 차이가 있을 것으로 사료된다. 그러므로 각 알레르겐에 대해서 강한 양성반응을 보이는 혈청 pool을 보관하고 있으면 이 방법을 알레르겐 표준화에 사용할 수 있을 것이다.

3. Allergen-dot assay의 intra 및 inter-experimental variation은 용납할만하며 또 이 검사는 대량의 myeloma IgE에도 영향을 받지 않았다.

4. Allergen dot assay의 결과로 나타나는 densitometry수치(mm)는 특이 IgE의 농도에 따라 dose-response curve를 보였다.

5. Solid phase dactylus와 결합한 오리새 특이 IgE를 알카리완충액으로 분리시킨 eluate 내에 비교적 많은 양의, 생물학적으로 정상적인 기능을 가진 오리새에 대한 특이 IgE가 함유되어 있었으며, 이것내에 존재하는 특이 IgE를 정량하여 표준농도의 용액으로 이용하여 환자혈청의 오리새 특이 IgE를 정량하였다.

6. Dactylus-RAST class와 측정된 dactylus-lgE값 사이에는 낮은 RAST class(1+∼3+)군에서는 어느 정도 연관성이 있어 보였지만, 피부반응 검사의 정도와는 특별한 상관성을 나타내지 못하였다.

이상의 결과를 요약하면, nitrocellulose filter paper를 알레르겐 특이 IgE측정의 solid please로 이용이 가능하고, 또 알카리 완충액을 사용하여, solid phase 알레르겐과 결합한 특이 IgE를 유리시켜 얻은 eluate를 표준농도의 용액으로 사용하면, 알레르겐 특이 IgE론 어렵지 않게 정량적으로 측정할 수 있어 알레르기 질환의 원인 알레르겐의 규명 및 치료경과에 따른 특이 IgE의 변동등을 관찰하는데 유용하게 이용될 수 있으리라 사료된다.

[영문]

Allergen dot-immunobinding assay was performed with the nitrocellulose filter paper on which timothy and dactylus pollen extract were dotted, as solid phase and horseradish peroxidase conjugated monoclonal anti-lgE antibody (BS^^17), as detectinG antibody.

On the allergen dot-immunobinding assay, the optimal incubation time of serum and detect-ing antibody were 18 hours and 6 hours respectively.

The optimal dotting amounts of allergens were one ㎍ of timothy and 8 ㎍ of dactylus.

The densitometer readings of dactylus dot-immunobinding assay revealed a dose-response curve according to serum dilution and note4 soma relation with cpm of semiquantitative Phadebas RAST. The intra and inter-experimental variations of allergen dot-immunohinding assays were acceptable. There were no densitometer

readings when the dactylus dot-immunobinding assays were performed with the solutions containing 10,000, 5,000, 2,500 anti 1,000u/ml of myeloma IgE (GB).

In three kinds of eluates which were made by alkali buffer (pH 11.0), acid buffer (pH3.0) and chaotrophic ion (3M NH^^4 SCN) solutions, the alkali eluate contained the largest amounts of biologically active dactylus specific IgE. The absolute amounts of dactylus specific IgE in this alkali eluate were measured by modified immnunoadsorption technique. Using this alkali eluate, as standard solution of dactylus specific IgE, dactylus specific IgE of patients' sera were quantitatively measured by dactylus dot-immunobinding assay.

According to the standard curve. the low limit of specific IgE detected by the dactylus dot-immunobinding assay was 0.1 u/ml.

The quantitative amounts of dactylus specific IgE from patients' sera (86 samples) were compared with the results of Phadebas RAST and of the dactylus skin test.