인터루킨-15가 인간면역결핍바이러스 감염자의 자연살해세포에 미치는 영향

Abstract

[한글]

Human immunodeficiency virus (이하 HIV) 감염에서는 광범위한 면역체계의 이상이 동반되며 그 중의 하나가 자연살해작동의 감소이다. 인터루킨-15(Interleukin-15; 이하 IL-15)은 HIV의 면역치료로 활발히 연구되고 있는 cytokine이다. IL-15은 HIV 감염자의 자연살해세포를 자극하여 자연살해작용을 증가시키며 여러 가지 면역세포로부터 CC-chemokine을 분비시켜서 각종 면역세포를 집결시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 IL-15이 HIV 감염자의 자연살해세포에서 어떠한 기전으로 자연살해작용을 증가시키는지는 알려진 바 없으며, IL-15이 증가시키는 CC-chemokine과 자연살해세포작용의 연관성이 불분명한 실정이다. IL-15을 HIV 감염에서 면역치료로 고려하기 전에 이러한 상관관계를 이해하는 것이 필요하다. 이에 저자는 IL-15이 HIV 감염자 자연살해세포의 자연살해작용에 미치는 영향과 기전을 연구하기 위해서 HIV에 감염된 환자 8명과 정상인 10명의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 자연살해세포를 분리한 후 IL-15을 투여하여 자연살해작용의 변화를 K562세포를 표적세포로 하여 4시간 (51)**Cr 방출법으로 측정하였다. 이때 자연살해세포로부터 분비되는 macrophage inflammatory protein-1α(MIP-1α), macrophage chemotactic protein-1(MCP-1) 그리고 regulatedupon activation, normal T cell expressed and secreted(RANTES) 등의 CC-chemokine 농도를 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)로 측정하여 IL-15이 자연살해세포에서의 CC-chemokine의 표현에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 RANTES와 자연살해작용의 직접적인 연관성을 보기 위해서 RANTES의 중량투여와 anti-RANTES antibody를 첨가한 후의 자연살해작용의 변화를 보았다. IL-15이 자연살해세포를 자극한 후에 자연살해작용이 증가하는 과정에서 세포내의 변화를 조사하기 위해, 세포용해 효소의 표현 정도를 granzyme B와 perform의 Westem blot으로 확인하였고, 세포의 P-glycoprotein 표현과 P-glycoprotein의 기능을 대변하는 rhodamine123 efflux를 flow cytometry로 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 정상인의 자연살해세포에서는 주효세포와 표적세포 비율의 증가에 따라 자연살해작용이 증가한 반면, HIV 감염자의 자연살해세포에서는 주효세포를 늘려도 자연살해작용은 증가하지 않았다. 그러나 IL-15 투여 시 자연살해작용이 증가하였다.

2. IL-15을 0, 10, 100, 1000 ng/ml으로 증량할 때 자연살해작용은 정상인의 자연살해세포와 HIV감염자의 자연살해세포 모두에서 용량의존적으로 증가하였다.

3. IL-15으로 자극할 때 분비되는 MIP1-α, MCP-1, RANTES의 농도는 정상인의 자연살해세포와 HIV감염자의 자연살해세포에서 차이가 없었다.

4.정상인의 자연살해세포와 HIV감염자의 자연살해세포에서 측정한 자연살해작용은 RANTES 투여 양에 비례적으로 증가하였으며, 이는 anti-RANTES antibody에 의해 차단되었다.

5. IL-15으로 자극한 자연살해세포의 세포 내 granzyme B와 perforin의 표현정도는 정상인의 세포와 HIV 감염자의 세포 모두에서 증가하였으며 두 군간에 차이는 없었다.

6. p-glycoprotein의 표현은 정상인의 세포에 비해 HIV 감염자의 세포에서 낮은 경향을 보였으며, IL-15 투여 후에는 HIV 감염자의 세포에서 증가하는 경향을 보였다.

7. Rhodamine123이 자연살해세포에 유입된 후 세포 밖으로 배출되는 양은 정상인의 세포에 비해서 HIV 감염자의 세포에서 의의있게 낮았으며, IL-15 투여 후에는 HIV 감염자의 세포에서 의의있게 증가되었다.

본 연구의 결과로 HIV 감염자의 자연살해세포는 정상인의 자연살해세포와 마찬가지로 IL-15으로 자연살해작용이 증가하고, 이 과정에서 IL-15은 자연살해세포를 자극하여 MIP1-α, MCP-1, RANTES 등과 같은 CC-chemokine 분비를 유도하며, CC-chemokine 중에서 특히

RANTES는 자연살해세포에 직접적으로 작용하여 자연살해작용을 증가시킴을 확인할 수 있었다. IL-15이 자연살해세포를 자극하여 정상인의 세포와 HIV 감염자의 세포 모두에서 perforin과 granzyme B 표현을 증가시키지만, p-glycoprotein의 표현과 작용은 HIV 감염자의 세포에서만 증가하므로 IL-15이 HIV 감염자의 자연살해세포에서 자연살해작용을 증가시키는 기전 중에 P-glycoprotein의 회복이 관여할 것으로 생각된다.

[영문]

Depressed levels of natural killer (NK) cell activity is one of the various immunologic abnormalities observed in human immunodeficiency virus (HIV) infection. Interleukin-15 (IL-15) is a cytokine considered as an immunotherapeutic candidate in HIV infection. IL-15 is known to increase NK cell activity and excrete CC-chemokines from divergent immune cells for their chemotaxis. The mechanism of enhancement of NK cell activity by IL-15 in HIV infection is indefinite and the relationship between CC-chemokines and NK cell activity after IL-15 stimulation is not clearly established. These obscure relations need to be elucidated before IL-15 is further studied as an immunotherapeutic cytokine. The present study was carried out to examine the effects of IL-15 on NK cells of HIV-infected persons and investigate the mechanism of their effects.

NK cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells of eight patients confirmed as HIV infection and 10 healthy blood donors. IL-15 was dose escalated and NK cell activity was measured by (51)**Cr release assay-Concentrations of MIP1-α, MCP-1, and RANTES excreted from NK cells with IL-15 stimulation were quantitated by ELISA. The relationship between CC-chemokines and NK cell activity was revealed by dose escalation of RANTES, addition of anti-RANTES antibody and control isotype antibody and measuring subsequent NK cell activities. to observe intracellular changes of NK cells when NK cell activity is increased after IL-15 stimulation, cytolytic enzyme content such as granzyme B and perforin were analyzed by Westem blot, and the transmembrane P-glycoprotein expression and rhodamine 123 efflux assay were analyzed by flow cytometry. The following results were obtained.

1. While NK cell activity of healthy donors increased as the effector to target cell ratio increased, NK cell activity of HIV infected persons showed no change. With IL-15 stimulation, NK cell activity increased as the effector to target cell ratio increased in NK cells of both HIV-infected persons and healthy donors.

2. With dose escalation of IL-15 (0, 10, 1OO, 1000 ng/ml), NK cell activity increased dose dependently in both HIV -infected persons and healthy donors.

3. Concentrations of MIP1-α, MCP-1, and RANTES excreted from NK cells with IL-15 stimulation showed no difference between HIV-infected persons and healthy donors.

4. NK cell activity increased proportionally with dose escalation of RANTES and was blocked with anti-RANTES antibody in NK cells of both HIV-infected persons and healthy donors.

5. Granzyme B and perform contents were increased after IL-15 stimulation in NK cells of both HIV-infected persons and Healthy donors and no significant difference was observed.

6. P-glycoprotein expression showed a tendency to be decreased in NK cells of HIV-infected persons compared to healthy donors, and after IL-15 stimulation, was increased in NK cells of HIV-infected persons.

7. Percentage of effluxed rhodamine 123 was significantly lower in NK cells of HIV-infected persons compared to healthy donors. After IL-15 stimulation, rhodamine 123 efflux increased in NK cells of HIV-infected persons.

In conclusion, NK cell activity increased with IL-15 stimulation in NK cells of HIV-infected persons as is in normal NK cells. IL-15 stimulates NK cells to secrete CC-chemokines such as MIP1-α, MCP-1, and RANTES, and RANTES itself eventually

increases NK cell activity. IL-15 stimulation of NK cells increases perforin and granzyme B in NK cells of both HIV-infected persons and healthy donors. However, decreased P-glycoprotein expression and function is restored only in NK cells of HIV-infected persons after IL-15 stimulation. Therefore, P-glycoprotein may play a role in the mechanism of increased NK cell activity in NK cells of HIV-infected persons after IL-15 stimulation.