HLA항체 양성 토끼에서 산처리 혈소판의 체내 생존능 평가

Abstract

[한글]

혈소판수혈불응증은 혈소판 수혈 후 예상한 만큼 혈소판수가 증가하지 않는 것을 의 미하며 다회 혈소판 수혈환자의 30∼70%에서 발생한다. 혈소판수혈불응증의 원인은 출혈, 발열, 패혈증,파종성혈관내응고증,비종대 등의 비면역성 원인을 제외하면 HLA항체에 의한 동종면역이 대부분을 차지하는데,최근 일부에서 동종면역으로 인한 혈소판수혈불응증 환자에서 산처리로 Hl,A항원을 용출시켜 제거한혈소판의 수혈이 시도되고 있다. 이에 본 연구에서는 산처리를 통한 혈소판 Hl.A항원의 제거를 극대화하는 동시에 혈소판 기능은 유지시킬 수 있는 최적 산도.7_구하고HLA항체 양성 토끼에서 산처리 혈소판의 체내 생존능을 평가하고자하였다.

산처리를 위한 최적 산도를 구하기 위하여 pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6의 산용핵을 각각 제조한 후 사람 혈소판과 반응시켜 산처 리 전후의 HLA항원과 혈소판특이항원의 표현율을 유세포분석법으로 측정하였고 혈소판 기능의 변화를 알아보기위해 혈소판응집능겁사를 시행하였다. 토끼 14마리 중 음성 대조군 4마리, HLA항체 양성 산처 리군 5마리, HLA항체 양성 비처리군 5마리로 나누어 HLA항체 양성군은 사람 혈소판을 1주에 1회씩,총 6주간 수혈하여 면역을 유발하였다. 면역 유발후 토끼 혈청 에 HLA항체 존재를 효소면역 법으로 확인하였고, 음성 대조군과 HLA항체 양성 비처리군에는 산처리하지 않은 혈소판을, HLA항체 양성 산처리군에는 산처리한 혈소판을 수혈하였다. 혈소판 수혈 후 일정 시간 간격으로 토끼 혈액을 채취하여 FITC로 표지된 anti-CD42a를 사용하여 사람 혈소판의 생존기간을 계산하였다. 산처리 후HLA항원의 재생산과 흡착정도를 알아보기 위하여 산처리 혈소판을 인산완충식염수 및 혈장과 각각 반응시켜 시간경과에 따른 HLA항훤 표현율을 측정하였다.

산처리 후 HLA항원 표현율은 pH 2와 pH 3에서 각각 21.0%와 21.2%로 가장 낮았고, 산처 리 후 혈소판 기능은 pH 3, ply 4, pH 5에서 비슷하였으나 pH 2에서 ADP에 대한 반응이 36%로 감소하였다. 산처리시 생길 수 있는 세균오염 여부를 알아보기 위해 실시한 세균

배양 검사는 모두 음성이었다. HLA항체 음성 대조군에서 산처리하지 않은 혈소판의 반감기는 11.8±3.7시간,HLA항체 양성 토기에서 산처리 혈소판의 반감기는 9.5±5.5시간, HLA항체 양성 토끼에서 산처리하지 합은 혈소판의 반감기는5.9±2.9시간이었다. HLA항체 음성 대조군에서 산처리하지 않은 혈소판과 HLA항체 양성 토끼에서 산처리하지 않은 혈소판의 반감기의 차이는 통계학적으로 유의 하였으나(p=0.027), HLA항체 음성 대조군에서 산처리하지 않은 혈소판과HLA항체 양성 토끼에서 산처리 혈소판의 반감기의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(p=0.221).산처리 후 혈소판 자체의 HLA항원 재생산은 2시간까지 급격히 증가하였다가 이후24시간까지 완만하게 일어나서 산처리 전 HLA항원 표현율의 84%에 도달하였고, HLA항원의 흡착은 2시간에서 4시간 사이에 최고에 도달하였으며 그 이후에는 더 이상 일어나지 않았다.

HLA항원의 제거를 극대화하는 동시에 혈소판 기능을 유지시킬 수 있는 최적 산도는 pH3이었고 HLA항체 양성 토끼에서 산처리 혈소판과 음성 대조군에서 산처리하지않은 혈소판의 반감기가 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았으므로 동종면역으로 인찬 혈소판수혈불응증 환자에서 산처리로 HLA항원을 제거한 혈소판의 임상적 적용 가능성을 확인할 수 있었다. 그러나, 산처리 후 HLA항원의 내부적인 재생산 및 흡착에 의해 24시간 이내에 lILA항원 표현율이 급격하게 증가하여 산처리 전의 95%까지 회복되는 것으로 보아 산처리 혈소판 수혈 후 예상되는 혈소판 수혈 효과가24시간이상 지속되지 못할 가능성도 있음을 배제할 수는 없었다.

[영문]

Platelet refractoriness, defined as a poor increment of platelet count following platelet transfusion, has been reported to occur in 30 ∼70% of multitransfused patients. This can result by either immune or nonimmune mechanisms. The predominant immune cause of platelet refractoriness is alloimmunization to HLA class Iantigens. Recently, acid-treatedplatelets have been used in a few patients with platelet refractorilless due to HLA alloantibodies. However, the e(fact of acid-treated platelets has not been consistent. The aims of this study were to elucidate the optimal pH of acid treatment and evaluate the in vivo survival of

acid-treated, HLA-eluted platelets in HLA-immunized rabbits.

In order to determine the optimal pH of acid treatment, we investigated the HLA expression by flow cytometry and the platelet function by a platelet aggregationtest beforeand after acid treatment at pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, and pH 6, respectively. For in vivo survival test, fourteen New Zealand White rabbits were studied. Four rabbits were in the nonimmunized control and 10 were immunized by weekly transfusions of human pooled platelets for 6 weeks. After the completion of the immunization, blood was obtained from each rabbits and all of the immunizations

were confined with HLA antibodies in sera using Quik screen (GTI, USA) ELISA kits.

HLA-immunized groups were separated in two groups with transfusion of acid-treated platelets and untreated platelets. The survival of transfused platelets to rabbits with immunization and control group was estimated 7y a flow cytometerusing HTC-labeled anti-CD42a. We also examined the HLA re-expression in acid-treated platelets due to regeneration and adsorption of HLA from human plasma.

The HLA expression which was 87.6% before acid treatment decreased to 21.0% and21.2% at pH 2 and pH 3, respectively. The platelet function studies showed that the aggregation of acid-treated platelets at pH 3, pH 4, and pH 5 induced by various agonists was only slightly reduced, However, at pH 2 the aggregation induced by ADP was less than 40%. The half-life of untreated platelets in nonimmunized rabbits was 11.8 ±3.7 hr. The half-life of acid-treated platelets in rabbits with HLA antibodies was 9.5 ± 5.5 hr and the half-life of untreated

platelets in rabbits with HLA antibodies was 5.9 ±2.9 hr. The difference between untreated platelets in the nonimmunized control group and acid-treated platelets in rabbits with HLA antibodies was statistically insignificant (p=0.221).

Re-expression of HLA-A,B,C by endogenous resynthesis occurred continuously, and after 24hr it reached 84% of pre-elution level. Adsorption of HLA antigens from human plasma was completed within 4 hr.

In conclusion, the optimal pH for HLA elution from human platelets was pH 3.Acid-treated, HLA-eluted platelets may be applicable for the patients with refractoriness to platelet transfusion, especially, in case of unavailability of HLA-compatible donors and fatal bleeding such as intracranial hemorrhage and pulmonary hemorrhage. However, the post-transfusion increment of the platelet count would not be maintained over 24 hr because of the endogenous resynthesis of HLA antigens.