사염화탄소에 의한 급성 간손상으로 활성화된 간성상세포에서 G1 Cyclin 및 Rb-E2F의 발현과 비타민 E의 효과

Abstract

[한글]

간섬유화는 만성 간질환의 진행과정에서 동반될 수 있는 병태생리학적 소견으로 만성 간질환의 진행 및 예후와 깊은 관련이 있다. 섬유화가 진행되면 결국 간경변증으로 진행하게 되므로 간섬유화의 정도는 만성 간질환의 경과와 예후의 예측에 있어 매우 중요한 인자이다.

여러 가지 원인에 의해 간성상세포가 활성화되면 세포외기질의 주요성분인 교원질과 평활근액틴의 발현이 증가되어 간섬유증이 유발되므로 간섬유증의 연구중 특히 간성상세포의 활성화에 대한 연구가 관심의 대상이 되고 있다. 간성상세포의 활성화 및 비활성화에

대한 기전을 이해하고 간섬유증에 대한 치료제의 개발을 위해서는 생체 내에서의 간성상세포의 활성화 모델을 확립하는 것이 필요하다. 그러나 급성 간손상 후에 간성상세포의 활성화가 주로 어느 시기에 이루어지고 활성화와 관련된 인자들이 주로 어느 시기에 발현되는 지는 아직도 확실히 알려져 있지 않다. 간성상세포가 활성화되면 증식도가 증가하며 따라서 세포들이 S기로의 이동이 증가하는데 급성 간손상시에 간성상세포의 세포주기 변화와 관련된 인자들에 대한 연구도 보고된 바가 거의 없다. 또한 대표적인 항산화제인 비타민 E가 간성상세포의 활성화를 억제할 수 있다고 알려져 있으나 실제로 생체에서 급성 간손상후에 간성상세포에서의 NF-kB 및 세포주기 변화와 관련된 인자들에 미치는 영향에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 이에 저자 등은 사염화탄소 투여로 유발된 급성 간손상의 생체 모델에서 간성상세포의 증식도 및 활성도의 시간에 따른 변화와 이에 관련된 인자들인 cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2, Rb, E2F-1 및 NF-kB의 시간에 따른 변화를 살펴봄으로써 간성상세포 활성화의 생체 모델을 확립하고 세포주기와 관련된 인자들의 변화를 알아보았으며 산화성 스트레스에 의한 간손상에서 항산화제인 비타민 E의 투여가 간

성상세포의 증식도 및 활성도와 관련된 인자들에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

본 연구에서는 Sprague-Dawley 웅성 흰쥐를 사용하였으며 1군은 대조군으로 사염화탄소를 복강 내에 1회 투여하였고, 2군은 사염화탄소 투여 2일전부터 희생시킬 때까지 매일 비타민 E를 복강 내에 투여하였다. 두 군 모두 사염화탄소 투여 전 및 투여 후 8시간, 16시간, 32시간, 48시간 및 60시간에 각각 5마리씩 희생시켰으며 각각의 시기마다 혈액을 채취하여 혈청 ALT를 측정하였고, 간성상세포의 활성도를 보기 위해 알파 평활근액틴을 면역조직화학 염색법으로 측정하였으며 간성상세포의 증식도를 보기 위해 [(3)**H]thymidine 결합을 측정하였다. 간성상세포 및 핵을 분리하여western blot으로 cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2 및 Rb를, electrophoretic mobility shift assay로 E2F-1과 NF-kB를 관찰하였다.

1) 사염화탄소에 의한 급성 간손상에서 혈청 ALT는 투여 후 32시간에 가장 높은 증가를 보였는데 이 시기에 간성상세포의 증식도를 반영하는[(3)**H]thymidine 결합과 간성상세포의 활성도를 반영하는 알파 평활근액틴도 가장 높은 증가를 보였고, 혈청 ALT, 간성상세포의 증식도 및 활성도 간에 서로 유의한 상관관계를 보여서 간손상의 정도가 심할수록 간성상세포의 증식도 및 활성도가 증가함을 알 수 있었다.

2) 간성상세포의 세포주기 변화와 관련된 인자들 중 G1 cyclins의 경우 cyclin D1은 투여 후 32시간에 cyclin E는 투여 후 16, 32, 48시간에 뚜렷하게 발현되었고, cyclin D1 및 cyclin E와 결합하여 Rb를 인산화시키는 G1 CDK인 CDK2와 CDK4도 투여 후 16, 32, 48시간에 뚜렷한 발현이 관찰되었으며 Rb는 투여 후 16, 32, 48시간에, 인산화된 Rb에서 떨어져 나온 전사인자인 E2F-1은 투여 후 16, 32시간에 뚜렷한 발현이 관찰되어 사염화탄소에 의한 급성 간손상에서는 16, 32, 48시간이 간성상세포의 세포주기 변화와 관련된 인자들이 가장 뚜렷하게 발현되는 시기였다.

3) 사염화탄소에 의한 급성 간손상에서 증가하거나 발현되는 혈청 ALT, 간성상세포의 증식도, 간성상세포의 활성도, cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2, Rb, E2F-1의 일련의 변화들이 항산화제인 비타민 E를 투여한 군에서 유의하게 감소하거나 발현이 소실되었고, 산화성 스트레스에 의해 활성화되며 세포의 증식과 관련된 NF-kB의 발현도 억제되었다.

이상의 연구결과로 사염화탄소 1회 투여로 유발된 급성 간손상에서 간성상세포의 활성화에 대한 생체 모델을 확립할 수 있었고, 간성상세포의 세포주기 변화와 관련된 인자들의 변화를 살펴보았으며 산화성 스트레스에 의한 간손상에서 항산화제인 비타민 E가 간성

상세포에서 NF-kB 및 세포주기 변화와 관련된 인자들의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.

[영문]

Hepatic fibrosis is closely related with the progression and prognosis of chronic liver disease. Once viewed as a static and irreversible response to chronic injury, fibrosis can now be seen as a dynamic and potentially reversible process. The enlightened perspective results on hepatic fibrosis : (a) characterizing the

components of extracellular matrix (ECM) ; (b) identifying the cell types responsible for ECM accumulation ; (c) establishing the roles of related cytokines ; (d) uncovering the presence of matrix-degrading proteases. Hepa tic stellate cells are a major source of ECM in liver injury. Although the study on the activation of hepatic stellate cells is a subject of interest, it is obscure when the activation of hepatic stellate cells occurs and the expression of its related factors are increased in acute liver injury. Oxygen-derived (roe radicals may play an important role in hepatic injury and vitamin E, antioxidants, is expected to decrease cell injury and prevent hepatic fibrosis. Therefore the purpose of this study was 1? establish the model of hepatic stellate cell activation in acute liver injury and 7? find the possibility of vitamin I for treating hepatic fibrosis. Male

Sprague-Dawley rats were used. The one group received a single injection of CC14 and the other group received injection of vitamin I daily until sacrifice as well as a single injection of CC14. Stellate cells were prepared from rats and nuclei were also prepared. The serial changes of serum ALT,(3H)thymidine uptake, α-SMA, cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2, Rb, E2F-1,NF-kB were measured.

1) The seria] changes of serum ALT levels, [(3)**H]thymidine uptake, α-SMA positive cells showed maximum increase at 32hr after CC14 injection, which was significantly decreased with administration of vitamin E.

2) Western blot of cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2 and Rb showed definite band at 16, 32, 48hr after CC14 injection, which were diminished or disappeared with administration of vitamin E :.

3) Electrophoretic mobility shift assay of E2F-1 and NF-kB showed definite band shift at 32hr after CC14 injection, which were diminished or disappeared with administration of vitamin E.

In conclusion, we were able to establish the in vivo-model of hepatic stellate cell activation in acute liver injury and to confirm the inhibiting effect of vitamin I (or NF-kB and the factors related to the change of cell cycle.