당뇨 흰쥐에서 근위 요도의 이완과 Nitric Oxide Synthase 함유신경의 변화

Abstract

[한글]

서론 : 당뇨병의 합병증으로 오는 당뇨병성 방광병증은 상당히 많은 환자에서 발병하여 삶의 질적인 면에서 치명적인 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이의 원인은 방광쪽 신경의 이상에 의한 방광의 기능 이상으로 알려져 왔으나, 임상 증상과 당뇨병성 합병증의 기전을 고려하여 볼 때 요도의 이상도 동반될 가능성이 많으며, 이런 요도의 변화가 방광병증의 병태생리학적 측면에서 더 중요한 역할을 할 가능성이 있다. 이에 본 연구에서는 인슐린 비의존형 당뇨병을 유발한 횐 쥐에서 기간별로 요도의 저항을 관찰하고 요도의 이완에 관여하는 Nitric Oxide Synthase(NOS) 함유 신경 의 이상을 확인하여 요도의 변화를 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법 : Ⅰ.실험군의 분류 : 인하대학교 의과대학 실험동물실에서 동일 조건하에 사육된 흰쥐 수컷(Sprague-Dawley) 57마리(200∼500 g)를 대상으로 하였다. 이들을 당뇨병 유발군(29마리)과 대조군(28마리)으로 나누어 12주, 24주, 36주에 실험을 시행하였는데, 실험은 크게 두 집단 즉 요역동학 검사군(39마리)과 요도 염색군(18마리)으로 나누어 각 집단에서 정상과 당뇨로 나누어 실험하였다. Ⅱ. 실험방법 : 1. 흰쥐에서 당뇨병 유도방법 : Weir의 방법을 이용하여 인슐린 비의존형 모델로 유도하였다. 2.요역동학 검사 : 요도의 저항을 알아보기 위하여 흰쥐에서 요역동학 검사를 시행하여 사람을 대상으로 한 연구에서 요도의 저항을 의미한다고 잘 알려져 있는 방광근 요누출시 압력(detrusor leak point pressure; detrusor LPP)이라는 변수를 측정하였다. 정상 및 당뇨병 흰쥐에서 약물 처치 없이 요역동학 검사를 시행한 집단과 약물들[L-Nω-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME); 20 mg/kg, sodium nitroprusside(SNP); 2 mg/kg]을 주입 후 요역동학 검사를 시행한 집단에서 각 연령군에서 약물 처치전과 후의 방광근 요누출시 압력을 비교 분석하였다. 3.요도의 NOS면역조직화학 염색 : 근위요도에서 NOS함유신경의 감소여부를 화인하기 위하여 nNOS에 대한 면역조직화학 염색을 대조군과 당뇨병군에서 avidin-biotin-peroxidase complex method(ABC-P) 방법을 이용하여 시행하였다. 4. 통계처리 : Student's t-test를 이용하여 검정하였으며, P 값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.

결과 : Ⅰ. 당뇨병의 유도 : 혈당은 신생아시기에 streptozotocin(STZ)을 주입 후 일주일 내에는 약 275 mg/dl 이상의 혈당을 보이다가 생후 한 달까지는 정상의 혈당을 보였고, 이후 흰쥐의 사춘기로 여겨지는 6주부터 200 mg/dl부터 500 mg/dl까지의 혈당을 보였다. Ⅱ. 요역동학 검사 : 1. 당뇨병 흰쥐는 정상 흰쥐에 비해 방광의 용적이 증가해 있어 12주부터 방광병증의 이환이 시작된 것을 알 수 있었다. 2. 당뇨병 횐 쥐에서 정상 흰쥐보다 요도의 저항이 증가되어 있는 것이 확인되었다. 그러나 36주 이후에는 정상 흰쥐에서도 요도의 저항이 증가되어 있어 이는 노화와 같은 다른 기전에 의한 것으로 여겨진다. 3. Nitric Oxide(NO) 억제제를 주입하고 요도의 저항을 살펴본 결과 정상 흰쥐에서는 저항이 증가하였으나 당뇨병 흰쥐에서는 증가하지 않는 경향을 보였다. 4. NO공여자를 주입하여 요도의 저항을 살펴본 결과 요도근의 기능은 비교적 늦게까지 살아있는 것으로 보인다. Ⅲ. 요도의 NOS면역조직화학 염색 : 방광경부의 NOS에 대한 면역조직 화학 검사에서 당뇨병 흰쥐에서는 NO 신경들의 수와 면역 염색성이 시간이 지날수록 감소되어지는 것을 알 수 있었다.

결론 : 당뇨병의 유병 기간이 길수록 요도의 저항이 높아지고 이는 요도의 이완을 담당하는 NO 신경의 파괴가 그 원인으로 사료된다. 기존의 연구에서 당뇨병성 방광병증의 원인으로서 방광의 신경이상으로만 설명하였던 것과는 달리 다발성 신경병증의 일종으로 방광 신경이상과 함께 요도의 이완장애로 인한 만성적인 배뇨장애 역시 그 기전의 하나일 것으로 사료된다. 그러나 당뇨에서 기간에 따른 변화를 나타내는 신경의 범위와 방광근 자체의 이상, 감각신경의 역할 등과 같이 아직 밝혀지지 않은 다른 기전에 대한 정확한 원인 등에 대해 추후 세부적인 분석과 실험이 수행되어져야 할 것으로 생각된다.

[영문]

Introduction : It is reported that as many as 83% of all patients suffering from diabetic neuropathy have voiding dysfunction manifested by an abnormal cystometrogram and a grossly enlarged bladder. Previous investigations on bladder

innervation and function led to the conclusion that voiding dysfunction in the diabetic patient is resulted from autonomic and sensory neuropathy, of bladder which shows typical loss of bladder sensation and contractility. In contrast, few investigation was focused on urethral factor as a cause for voiding dysfunction in the diabetics. Recently, nitric oxide was found to be an important neurotransmitter to mediate urethral relaxation.

We herein, evaluated whether and how urethral factor is responsible for voiding dysfunction in the diabetic rats.

Materials and Methods : Total,57 male Sprague-Dawley rats(29 diabetic and 28 control;200 ∼500 g in weights), breeding from birth, were included in this study.

Non-insulin dependant diabetes mellitus(NIDDM) was induced using Weir's method, by intraperitoneal administration of streptozotocin(90 mg/kg) on the second day after birth. Experiments were done at the age of 12, 24, and 36 weeks for urodynamic study(n=39) and immunohistochemistry(n=18). To evaluate urethral relaxation, detrusor leak point pressure(detrusor LPP)on the urodynamic study was observed in

diabetic and control rats. The effect of intravenous injection of

L-nitro-arginine-methyl ester(L-NAME, 20 mg/kg) or sodium nitroprusside(SNP, 2 mg/kg) was also observed. To evaluate nitric oxide synthase(NOS) containing nerve, immunohistochemistry was performed using rabbit anti-nNOS in diabetic and control rats. For the statistical analysis of the data, two-tailed, unpaired Student's f test was used. f valueless than 0.05 was regarded as statistically significant.

Results : Blood glucose level in the experimental rat was increased immediately after injection of STZ followed by gradual decrease during prepubertal period(2∼6 week). Then, it increased again at the puberty(from 6 week), maintained 200 ∼500 mg/dl throughout the adolescent period, which was compatible to the finding of NIDDM. On the urodynamic study, bladder capacity was much more increased in diabetic rats than control rats from the age of 12 weeks on detrusor LPP was significantly higher in diabetic rats than control rats at the age of 12 and 24 weeks. After intravenous injection of L-NAME, no change indetrusor LPP was observed in the diabetics while it was significantly increased in controls. After intravenous injection of SNP, detrusor LPP was decreased in both diabetics and controls. Urethral immunohistochemistry showed that the number and immune-reactivities of nNOS containing nerve fibers in diabetics were significantly decreased, compared to those in controls. Those findings were also prominent in older age within the group of both diabetics and controls.

Conclusion : The results indicate that urethral resistance is gradually increased along with the duration of diabetes, which is resulted from reduction of urethral nitric oxide synthase. Urethral factor, in addition to cystopathy, has an important

role on the pathogenesis of voiding dysfunction in patients with diabetes. This may suggest the change in treatment stratage in DM cystopathy.