인체 유방암종에서 Matrix Metalloproteinase와 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase의 발현과 맥관형성 및 침윤과의 관계

Abstract

[한글]

유방암의 예후는 종양의 크기와 림프절 전이가 중요한 독립적 예후 인자로 알려져 왔다. 그러나 유방암중 재발 가능성이 높은 고위험군을 선별할 수 있는 보조적 예후인자는 특히 조기 질환의 치료 방침을 결정하는데 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 종양세포의 전이 기전은 많은 생화학적, 세포생물학적 과정을 거치는데 단백분해효소의 기저막 분해가 중요한 과정 중의 하나이다. 금속의존성 기질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)중 MMP-2(gelatinase A, 72kDa)는 콜라겐 제 Ⅳ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅹ형 및 elastin, fibronectin

, gelatin 등을 분해하여, MMP-9(gelatinase B, 92kDa)과 함께 기저막의 주요 성분인 제Ⅳ형 콜라겐 분해에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 종양조직내 기저막의 분해는 분해 촉진인자와 억제인자 간의 불균형에 기인하는 바, tissue inhibitor of metallop

roteinase(TIMP)는 중요 억제인자의 하나로 촉진인자인 MMP의 활성화를 억제하고 적혈구 조혈, 배란 및 착상 등에도 그 역할이 알려져 있다. 최근 MMP와 TIMP가 맥관형성과 연관성이 있다는 보고도 있으며, 고형암의 하나인 유방암의 전이 및 재발에 관한 보고도 있다. 세포의 성장과 분화를 조절하는 성장인자와 암의 발생 및 진행 그리고 예후와의 연관성에 대한 연구도 활발히 진행되어 이 중 TGF-β^^1은 많은 연구에서 암종의 침윤과 전이를 결정하는 주요 인자로 추정되고 있고, 또 in vitro에서는 새로운 모세혈관의 형성을 증가시키는 것으로 보고되어 있어 종양내 맥관형성과도 밀접한 관계가 있음을 시사한다. 이러한 사실로 보아 원발성 유방암종에서 종양의 침윤 및 전이에 종양내 MMP와 TIMP의 발현세포와 발현정도가 중요한 관련성이 있다고 추정되며 MMP-2, 9와 TIMP-1, 2의 발현도를 각각 측정하여 TGF-β^^1의 발현 및 이들과 맥관형성과의 관계를 규명하고, 지금까지 알려진 예후인자, 특히 종양의 크기, 조직학적 등급, 핵 등급, 임상병기 및 림프절 전이 등과 생존 기간이 확인된 예에서 환자의 생존율과의 연관성을 알아보는 것은 매우 의의있다고 생각된다. 본 연구에서는 160예의 침윤성 유방암종 조직을 대상으로 MMP-2, 9, TIMP-1, 2 및 factor Ⅷ-related antigen과 TGF-β^^2에 대한 면역조직화학적 염색을 실시하여 이들의 발현과 유방암의 각 예후인자, 즉 종양의 크기, 림프절 전이 여부, 임상병기, 각각의 조직학적 및 핵 등급, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체와 재발과의 관계를 비교 분석하고, MMP, TIMP와 factor Ⅷ-related antigen 및 TGF-β^^1의 발현정도와 이들간의 연관성에 대하여 분석하였다. 또한 신선동결조직이 보관된 32예를 대상으로 웨스턴 블롯팅을 시행하여 정량분석과 함께 각 예후인자와 면역염색과의 비교분석을 시행하였고,

추적이 가능하였던 70예를 대상으로 각 예후인자 및 면역염색 결과에 따른 생존율 분석을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1) 침윤성 유방암종에서 종양의 맥관형성도는 종양의 크기, 림프절전이 여부, 임상병기 및 재발 여부에 따라 통계학적으로 의의있는 차이를 보였다.

2) TGF-β₁의 발현은 종양의 크기(>2cm), 림프절 전이 여부, 임상병기에 따라 의의있는 통계학적 차이를 보였다. 맥관형성도와의 비교에서 TGF-β^^1에 종양세포의 50% 이상이 양성인 경우 음성에 비해 미세혈관밀도가 의의있게 높았다.

3) MMP-2와 9의 면역염색 결과 양성발현은 림프절 전이가 있는 경우, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체에 음성인 경우에 통계적으로 의의있게 높았다. 또한 맥관형성도와의 비교해서 MMP-2에 양성 발현된 예의 미세혈관밀도가 의의있게 높게 나타났다.

4) TIMP-1과 2의 면역염색 결과 재발한 예에서는 각각 1예씩만 양성발현되었고, 임상병기에 따라서는 병기가 낮은 경우에 의의있게 높은 발현율을 보였다. MMP와 TIMP 간의 발현 여부와의 연관성 비교에서 다른 인자들과의 연관성을 찾을 수 없었으나 MMP-2 혹은 MM

P-9에 양성이면서 TIMP-1, 2가 모두 음성인 경우에 재발된 예가 많았다. 맥관형성도와의 비교에서 TIMP-1에 음성인 경우 미세혈관밀도가 의의있게 높았다.

5) 생존율은 기존에 알려진 각 예후인자 중 종양의 크기, 프로게스테론 수용체 유무 및 조직학적 등급에 따라 통계학적으로 의의있는 상관관계가 있었으며, MMP와 TIMP의 면역염색에서는 MMP-9의 발현과 생존율이 통계적으로 의의있는 관계가 있었으나, 다중 변수

분석에 의하면 종양의 크기와 MMP-9의 발현만이 비교적 독립적으로 영향력이 있는 인자들로 나타났다.

이상의 결과로 침윤성 유방암종에 MMP-2와 9의 면역염색 발현은 기존에 알려진 예후인자인 종양의 크기, 림프절 전이 여부, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체 유무와 연관성이 높고, TIMP-1과 2는 임상병기와 연관성이 있으며, 그 외 MMP-2와 TIMP-1은 미세혈관밀

도와, MMP-9은 생존율과 연관성이 있음이 관찰된 바 이들이 유방암 환자의 예후 예측표지자로서의 가능성이 있다고 생각된다.

[영문]

Prognosis of breast cancer is related to tumor invasion and metastasis. The extracellular matrix plays a major role in the multistep process of tumor invasion. At various stages, the invasive phenotype of tumor cells depends on interactions with and degradation of basement membranes, a highly regulated process involving an array of proteolytic activities. Among the enzymes responsible for basement membrane breakdown, matrix metalloproteinases(MMP) form a family of neutral preteases that are regulated at the levels of gene transcription, proenzyme

activation by cleavage of the protein and inhibition of the active enzyme by tissue inhibitors of matrix metalloproteinases(TIMP). Recent reports have demonstrated

that the expression of these proteolytic enzymes are elevated in several solid tumors and that it can be associated with invasiveness and poor prognosis. In this study, we examined the expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 by immuno-histochemistry in 160 cases and western blotting in 32 cases of infiltrating ductal carcinoma. And we compared these data with the established prognostic parameters - tumor size, nodal status, clinical stage, hormone receptor status, microvessel density and TGF-β^^1 expression to evaluate how MMP and TIMP expression are associated with breast cancer progression and prognosis.

The results are as follows;

1 . Microvessel density in invasive breast carcinoma was significantly correlated with tumor size and recurrence(p<0.O5).

2. Immunohistochemical expression of TGF-β^^1 was significantly associated with tumor size, lymph node metastasis and clinical stage (p<0.05). And microvessel density was significantly correlated with more than 50% TGF-β^^1 expression in tumor cells.

3. Immunohistochemical expression of MMP-2 and MMP-9 was significantly correlated with positivity fur nodal metastasis and negativity for estrogen and progesterone.

4. Immunohistochemical expression of TIMP-1 and TIMP-2 was inversely correlated with clinical stage and micorovessel density (only in TIMP-2) (p 0.05). But there was no significant inverse relationship between MMP and TIMP expression in conjunction with the previously proposed prognostic parameters. However, the number of cases showing MMP positivity and TIMP negativity, was slightly increased in recurred cases.

5. Small size of tumor, presence of progesterone receptor, highly differentiated histologic grade and less than 10% expression of MMP-9 were significantly associated with higher survival rate, but in multivariate analysis only tumor size

and MMP-9 expression appeared to affect survival independently.

In conclusion, immunohistochemical expression of MMP-2 and MMP-9 is associated with tumor size, lymph node metastasis status and hormone receptor status, and TIMP-1 and TIMP-2 is associated with clinical stage. Also the enhanced expression of MMP-2 and less than 10% expression of TIMP-2 are associated with higher

microvessel density and enhanced expression of MMP-9 is associated with lower survival rate. In breast cancer, MMP and TIMP and their relationship might be a potential prognosticator.