무균성 뇌막염 환자에서 분자생물학적 방법을 이용한 원인 바이러스의 규명

Abstract

[한글]

무균성 뇌막염의 진단은 세포배양과 표준혈청을 이용한 중화시험을 거쳐 바이러스를 동정하는 것이었으나, 최근 들어서 분자 생물학의 괄목할 만한 발전에 의하여 유전자 기법을 이용한 진단을 시도하려는 노력이 계속 되고 있다. 1990년 Rotbart 등이 장바이러스의 고도로 보존된 부위인 5'비부호결정부위에 대한 중합효소 연쇄반응을 장바이러스 질환의 진단에 처음으로 사용한 이후에 최근에는 더욱 간편하고 빠른 진단을 위한 kit까지 개발되어 있는 상태이다. 중합효소 연쇄반응은 세포배양-중화항체법에 비하여 빠르고 진단의 예민도를 높일 수 있으나 이 방법 단독만으로는 장바이러스들의 형을 진단하는 것이 불가능하다는 문제가 있다.

본 연구에서는 연세대학교 의과대학 세브란스병원의 무균성 뇌막염 환아에서 배양, 분리된 장바이러스에서 picornaviruses의 특징인 5' 비부호결정부위의 염기배열을 결정하여 무균성 뇌막염 환아에서 원인 바이러스의 진단을 위한 분자생물학적인 진단방법의 가능성과 향후 이를 이용한 세포배양-중화항체법의 대체 가능성을 알아보고자 하였다. 무균성 뇌막염으로 입원한 소아 환자의 대변으로 부유액을 만들어 이를 Hep-2 세포와 Rd 세포에 접종하여 세포병변 효과가 나타나는 경우 표준혈청으로 중화시험을 하고 세포병변 효과가 관찰된 세포배양액과 대변 부유액으로부터 장바이러스의 RNA를 추출하여 역전사 시킨 후 lijuka 등의 ENT1F, ENT2F, ENTR의 primer를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 특정 DNA 염기 띠를 확인하고 중합효소 연쇄반응 지향성 염기배열 결정법을 시행하여 확인된 염기배열을 DNAsis software를 이용하여 분석하고 제한효소 인식부위를 조사하여 이들 제한효소를 이용한 장바이러스의 분자생물학적 형결정을 할 수 있는지 알아본 바 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 환자로부터 얻은 검체를 가지고 장바이러스의 5' 비부호결정부위를 이용한 역전사-중합효소 연쇄반응을 실시한 결과 모두에서 특정 염기 띠가 관찰되었다.

2. 무균성뇌막염 환자의 대변부유액을 가지고 세포배양법과 중합효소 연쇄반응을 시행한 결과 장바이러스의 진단율은 각각 29.4%(17명중5명), 70.6%(17명중12명)으로 중합효소 연쇄반응에 의한 진단율이 더 높았다.

3. 환자로부터 분리된 장바이러스의 5' 비부호결정부위의 염기 배열들에 있어서 coxsackie B5와 echovirus 9은 94%로 가장 높은 동질성을 보였고 coxsackie B2와 echo-virus 7은 79%로 가장 낮은 동질성을 보였다. Coxsackie 바이러스 간에는 평균 87.5%의 동질성을, echovirus 간에는 평균 88.5%의 동질성을 보였다.

4.중합효소 연쇄반응 지향성 염기배열 결정법을 시행한 결과 얻은 436 bp의 염기 배열상에 바이러스의 형에따라 Nci I, Aos I, SfaN I, Esp I, Rsa I의 제한효소들의 특이한 인식 부위가 존재하였으며 이를 토대로 한 RFLP법으로 이들 장바이러스들의 형결정이 가능하였다.

5. 임의로 추출한 10명의 무균성 뇌막염 환자의 대변에서 분리한 장바이러스 RNA의 RFLP에 의한 형과 세포배양-중화항체법에 의한 혈청형을 비교한 결과 모든 환아에서 완벽한 일치를 보였다.

이상의 결과로 장바이러스의 형규명을 위한 진단방법으로서 RFLP법이 세포배양-중화항체법을 대체할 가능성이 있음을 알 수 있었으며 향후 이 방법의 신속성 및 정확성등에 대한 포괄적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

[영문]

Since the introduction of mumps vaccination, enteroviruses have been found to be the most common causative organism estimating 85% of aseptic meningitis in Korea. Recently, there have been two occasions of nationwide epidemics of aseptic meningitis caused by enteroviruses in 1993 and 1997.

Cell culture followed by neutralizing antibody test has been the mainstay for the diagnosis of aseptic meningitis, however, with the advancement of molecular biologic techniques, there have been continued efforts to develop more sensitive method, if any, for the isolation of causative organisms.

In 1990, Rotbart et al. introduced the polymerase chain reaction (PCR) method using 5' noncoding region(NCR) of the enteroviral genome for the diagnosis of aseptic meningitis. And therefore, many efforts and advancements in this field have been made.

PCR method is more sensitive and less-time consuming procedure than cell culture followed by neutralizing antibody test, but it is difficult to determine specific enteroviral serotypes with this method. The purpose of this study were to evaluate the applicability of a potential molecular biologic technique in determining the serotype of enteroviruses and to study its further possibility of alternative method for cell culture followed by neutralizing antibody test. In this study, fecal materials from the patients with aseptic meningitis were used for clinical specimens. Supernatant of fecal suspension was inoculated on the culture plate of Hep-2 cell and Rd cell lines, and total enteroviral RNA was extracted by Zoll's method from the cell culture soup and fecal suspension supernatant revealing the cytopathic effect. Using ENT1F, ENT2F, ENTR primer, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method was performed and specific enteroviral DNA bands were identified. The identified nucleotides were sequenced by the RT-PCR directed sequencing method and analysed with DNAsis software. And finally the restriction enzyme recognition sites were studied. The results were as follows:

1. The types of enteroviruses isolated from the patients diagnosed with aseptic meningitis were echovirus 9, 30 in 1993, echovirus 7 in 1994, coxsackie B3, echovirus 7 in 1995, coxsackie Bl, echovirus 30 in 1996, coxsackie B2, B5, B6 in 1997.

2. A specific fragment results from all of the aseptic meningitis patients by RT-PCR.

3. Enteroviral RNA was detected from 5 of 15(29.4%) by cell culture and neutralizing antibody method, and 12 of 17(70.6%) by RT-PCR method.

4. The nucleotide sequence homologies of the 5' NCR of coxsackie B1 isolated from 4 different patients with aseptic meningitis in same epidemic show 100% homology.

5. Nucleotide sequence homologies of the 5' NCR between coxsackie B2 and echovirus 9 show 94%, the highest homology among studied enteroviruses. And that between coxsackie B2 and echovirus 7 shows 79%, the lowest homology. But on average, there was 87.5% homology in coxsackie virus groups and 88.5% homology in echovirus groups.

6. Various enteroviruses types have a specific restriction enzyme recognition sites in their nucleotide sequences.

7. On comparison of enteroviruses serotyping results between cell culture and RFLP method with 10 randomly selected stool samples, there were 100% concordance.

It is concluded that RFLP method can be used for diagnosis and determination of the serotypes of enteroviruses isolated from our institute in alterative method of cell culture followed by neutralizing antibody test. And further inclusive studies for the rapidity and accuracy of this method are needed.