사람 암세포주에서 Fas ligand의 발현

Abstract

[한글]

Fas ligand(FasL)는 tumor necrosis factor(TNF) family에 속하는 분자로서 주로 활성화된 T 림프구의 표면에 발현되어 Fas를 발현하는 세포에서 apoptosis가 일어나도록 유도하는 기능을 하며, 면역특권(immune-privilege) 조직에서도 발현되어, 이들 조직에서 T 림프구의 apoptosis를 유도시켜 면역특권 상태를 유지하는데 관여한다. 또한, 암세포에서 발현되는 FasL는 T 림프구의 apoptosis를 유도하여, 암세포가 T 림프구의 세포독성 작용을 회피할 수 있다는 가설이 제시되었고, 이와 관련된 연구들이 진행되고 있다. 이에 본 연구에서는 간암, 대장암, 위암 등의 사람 암세포주에서 FasL가 발현되는지 살펴보고, 이러한 FasL가 Fas를 발현하는 세포의 apoptosis를 유도하는지 평가하고자 하였다. 또, 간암 세포주에서 B형 간염 바이러스에 의한 FasL 발현 유도를 조사하고, 실제 간암 조직에서 FasL 발현여부를 알아보았다. 이를 위해 간암, 대장암, 위암 등의 사람 암세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 FasL transcript를 검색해 본 결과, Hep G2.2.15, SNU-354 간암 세포주와 COLO 201, COLO 205 대장암 세포주에서 FasL가 강하게 발현됨을 관찰할 수 있었다. 또, Hep G2.2.15 세포에서 면역형광염색을 이용하여 FasL 단백이 발현됨을 확인할 수 있었고, RNase protection assay와 면역형광염색으로 Fas와 Fas 관련 유전자 발현을 관찰한 결과, Hep G2에 비하여 Hep G2.2.15에서 Fas와 FADD의 발현이 저하되

어 있음을 볼 수 있었다. FasL를 강하게 발현하는 HepG2.2.15 세포와 Fas를 잘 발현하는 T 세포 백혈병 세포주인 MOLT-4를 함께 배양하여, Hep G2.2.15 세포가 발현하는 FasL가 Fas를 발현하는 세포의 apoptosis를 유도할 수 있는지를 coculture DNA fragmentation assay를 이용하여 알아보았다. 그 결과, Hep G2.2.15 세포에 의해 MOLT-4 세포에서 apoptosis가 일어남을 볼 수 있었고, 이때 Fas를 통한 apoptosis를 억제하는 anti-Fas 항체, ZB4, 를 첨가하여 MOLT-4 세포에서 apoptosis 정도가 감소됨을 관찰함으로써 Hep G2.2.15 세포에 의한 MOLT-4 세포에서의 apoptosis가 Fas/FasL 분자를 매개하여 일어남을 증명하였다. 간암 세포주에서 FasL 발현에 B형 간염 바이러스 복제나 유전자 산물이 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해 PLC/PRF/5 세포주에 B형 간염 바이러스 유전자나 HB^^x 유전자

를 형질 도입시킨 결과, 이들 유전자에 의해 FasL 발현이 유도됨을 보았다 또한, RNase protection assay로 간암 조직에서의 FasL 발현을 조사한 결과, 1개 조직에서만 FasL 발현을 볼 수 있었다.

이상의 결과로 미루어, 일부 암세포는 FasL를 발현하며 FasL를 발현하는 암세포는 Fas를 발현하는 T 림프구의 apoptosis를 유발하여 숙주의 암세포에 대한 면역작용을 회피할 수 있을 것으로 기대할 수 있었고, B형 간염 바이러스 유전자 또는 HB^^x 유전자에 의해 FasL의 발현이 유도될 수 있음을 보았다.

[영문]

Fas ligand(FasL) which belongs to tumor necrosis factor(TNF) family and is mainly expressed on the surface of activated T lymphocytes, induces apoptosis of Fas-bearing cells. FasL is also expressed in immune privilege sites and induces apoptosis of T lymphocytes, therefore it plays a role in maintenance of immune privilege status. Recently, it has been postulated that tumor cells expressing FasL could evade immune-surveillance by inducing apoptosis in tumor infiltrating T lymphocytes expressing Fas. In this study, FasL expression was investigated in 13 human hepatoma, 6 colon cancer, and 3 gastric cancer cell lines and apoptosis of Fas-bearing cells was evaluated through coculture with tumor cells expressing FasL. Strong FasL transcripts were detected by RT-PCR in Hep G2.2.15, SNU-354 hepatoma cell lines and COLO 201, COLO 205 colon cancer cell lines. Cell surface expression of FasL on the Hep G2.2.15 was detected by immunofluorescence. Expressions of Fas and Fas-related genes were also determined by RNase protection assay. Fas and FADD expressions in the Hep G2.2.15 were lower than those in the Hep G2. To determine the biological activity of FasL, Hep G2.2.15 was cocultured with MOLT-4. Hep G2.2.15 induced apoptosis in MOLT-4 and this was inhibited by the antagonistic anti-Fas antibody, ZB4. For the further analysis of the role of hepatitis B virus(HBV) or HBx in the induction of FasL, PLC/PRF/5 cells were transiently transfected with HBV genome or HBx, and FasL transcripts were determined. In the PLC/PRF/5 cells transfected with HBV genome or HBx, FasL expression was detected by RT-PCR. FasL expression was also investigated in 15 hepatoma tissues, and only 1 hepatoma tissue showed FasL transcripts. These data show that tumor cells expressing FasL could induce apoptosis of Fas-bearing T lymphocytes and thereby evade immune-surveillance and HBx might play a role in the induction of FasL in hepatoma cells.