백서 ATP-citrate lyase 유전자의 promoter에 존재하는 cis-acting elements의 분석

Abstract

[한글]

ATP-citrate lyase는 세포질 내에서 일어나는 지방산과 cholesterol 생합성에 필요한 기질인 acetyl CoA를 공급해주는 효소이다. 즉, acetyl CoA는 mitochondria에서 합성된 후 oxaloacetate와 결합되어 citrate의 형태로 세포질로 운반되고, 세포질에서 citrate는 ACL에 의하여 재분해되어 acetyl CoA가 생성되며, 생성된 acetyl CoA는 지방산 합성과 cholesterol 합성의 기질로 사용된다. 이러한 이유로 ACL은 지방산 합성에 관여하는 효소의 하나로 알려져 있다. 간장조직이나 지방조직에서 이 효소의 활성은 식이 조절이나 여러 호르몬 처치에 따라 증가하는데, 이는 핵 내에서 일어나는 ACL유전자의 전사 활성이 증가하여 이로 인해 ACL효소의 양이 증가하기 때문이라고 알려져 있다. ACL효소의 활성 조절이 주로 전사 단계에서 이루어지므로 ACL활성 조절을 연구하기 위해서는 ACL promoter에서 활성 조절에 관여하는 전사인자를 규명하는 일이 무엇보다 중요하다. 본 연구에서는 ACL의 발현과 조절이 어떻게 이루어지고 있는지 알아보기 위해 백서 간장세포를 model로 하여 ACL 유전자의 promoter에 존재하는 cis-acting element를 DNase Ⅰ footprinting 방법 및 gel mobility shift assay로 확인하였고, 이 중 ACL promoter활성도 유지에 가장 중요한 부분이라고 알려져 있는 전사 시작 부위로부터 -530 bp이내에 존재하는 9개의 전사인자 결합 부위에 결합하는 전사인자들을 규명하였다.

ACL 유전자의 promoter에는 -419 bp 이내에 6개의 Spl family 전사인자 결합 부위 (box Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ)와 -419 bP에서 -530 bp부위에 C/EBP의 역 염기서열 부위 (box Ⅷ), 그리고 S^^14 유전자의 ChoRE 염기서열 부위 (box Ⅸ)가 존재하였다. 또한 현재가지

규명되지 않은 전사인자가 결합하는 부위 (box Ⅶ)가 존재하였다. 백서를 48시간 금식시킨 후 저지방/고함수 탄소 식이를 투여하여 ACL의 전사활성을 증가시키면 box Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ에 Spl family전사인자의 결합이 증가하였고, 금식시켰을 때는 이 부위에 Spl family전사인자 결합이 감소되었다. 특히 box Ⅵ에는 Spl family전사인자와 아직 밝혀지지 않은 전사인자가 동시에 결합하였다. Spl family 전사인자와 이 새로운 전사인자는 금식 후 저지방/고함수탄소 식이 투여 시 이들 box에 결합하는 양이 증가하는 것으로 미루어 ACL 전사 활성을 증가시키는 것으로 생각된다. 그러나 box Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ에는 전사인자의 결합이 금식 시에는 증가하고 금식 후 저지방/고함수탄소 식이 투여 시 결합이 매우 감소함이 관찰되었다. 이러한 사실은 백서를 금식시켰을 때 전사 억제인자들이 이 부위에 결합되었다가 저지방/고함수탄소 식이를 재투여하였을 때 이들의 결합이 해제됨으로써 ACL의 전사 활성이 증가된다는 것을 시사한다.

Box Ⅰ에서 Ⅸ까지의 box가 ACL promoter의 전사 활성도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 box가 제거된 ACL promoter-CAT (chloramphenicol acetyltransferase) construct를 일차 배양 간장세포에 transfection 한 후 CAT을 reporter로 하여 각 box의 활성을 측정한 결과 box Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ이 모두 제거된 construct는 이들 box가 존재하는 construct (100%)에 비해 활성이 증가하여 166.8±35.2%로 최고 활성을 보였다. -419 bp이내에 존재하는 6개의 bon (box Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ)중에 box Ⅴ와 Ⅵ가 제거된 construct는 최고의 활성을 유지하다가 box Ⅳ가 제거된 construct의 활성은 95.4±31.2%를 보였고 box Ⅱ와 Ⅲ가 제거되면 활성이 13.6±12.8%로 감소하였다.

따라서 ACL의 기본적인 전사 활성 조절에는 전사 시작 염기로부터 -300 bp 이내에 존재하는 4개의 Spl fmily 전사인자의 결합 부위가 가장 중요한 cis-acting element로 작용하며 -419bp에서 -530 bp 부위는 억제자로 작용하여 ACL의 전사를 조절하는 것으로 사료된다. 또한 Spl family에 속하는 전사인자는 저지방/고함수탄소 식이에 의한 ACL전사 증가에도 activator로 관여하고 -419 bp에서 -530 bp부위에 존재하는 전사인자 결합 부위들은 전사 활성이 억제된 상태에서 억제자의 기능을 하리라 사료된다

[영문]

ATP-citrate lyase(ACL) catalyzes the conversion of citrate to oxaloacetate and acetyl CoA in cytosol. In order to understand the regulatory mechanism of ACL by dietary status or hormones, the functional characterization of cia-acting elements in the promoter of rat ACL gene is necessary. In this study, the cis-acting elements in ACL promoter and their interaction with transcription factors were analyzed using DNase Ⅰ footprinting and gel mobility shift assay. DNase Ⅰ footprinting analysis revealed nine potential binding sites within -530 bp, which were named box Ⅰ to Ⅸ from the transcription start site. Of these, box Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, and Ⅵ were Sp l family binding sites. The reverse consensus sequence for C/EBP(CAAT enhancer binding protein, box Ⅷ), and ChoRE(carbohydrate response element, box Ⅸ) were also found. Spl family transcription factor binding to box Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ and Ⅵ was increased, whereas the protein binding to box Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ was decreased by low fat-high carbohydrate diet. In addition to Spl family binding, an unknown protein of low molecular weight was bound to box Ⅵ in low fat-high carbohydrate refeeding group. From these results, it is suggested that the Spl family is the transcription factor responsible for increased ACL transcription in the low fat-high carbohydrate refeeding group while the C/EBP and proteins binding to box Ⅶ, Ⅸ may act as repressors in the fasting state.

To confirm the physiological significance of the protein binding sites(box Ⅰ to box Ⅸ) in the hepatocytes, promoter activity using the serial deletion of ACL promoter constructed into CAT reporter gene was evaluated. The removal of box Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ caused an increase in chloramphenicol acetyltransferase(CAT) activity to 166.8±35.2% when compared to that of full-construct which contains the nine protein binding sites. The deletion of box Ⅴ and Ⅵ showed no significant reduction in CAT activity. However, the construct that lacks box Ⅳ showed 95.4±31.2% and the construct lacking box Ⅱ and Ⅲ showed 13.6±12.8% of the activity of the full construct. These results demonstrate the presence of enhancing elements(box Ⅰ-Ⅳ) responsible for expression of ACL as well as the inhibitory elements(box Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ) repressing the ACL transcription.