종양연관성 천포창 항원의 cDNA 클로닝

Abstract

[한글]

천포창 중 Anhalt 등에 의해 새로운 천포창으로 정의된 종양연관성 천포창은 여러 종류의 종양과 동반되어 점막부위에 심한 미란이나 궤양을 보이고 피부에 다형흥반, 천포창, 또는 독성 피부괴사와 같은 여러 형태의 발진을 보이는 질환이다. 자가면역수포성 질환인 종양연관성 천포창은 혈청학적으로 각질형성세포 표면에 있는 단백에 대한 자가항체가 발견되며, 환자의 혈청을 이용한 면역침전검사에서 250 kD, 230 kD, 210 kD, 190 kD의 4가지 단백으로 구성된 항원복합체를 확인할 수 있는데, 이 중 250 kD 단백은 desmoplakin

(DP) 1, 230 kD 단백은유천포창 항원 1(bullous pemphigoid antigen 1), 210 kD 단백은 DP ll로 알려져 왔으나, 190 1:D단백에 대해서는 현재까지 밝혀진 바 없다. 그러나 이와 같은 면역침전검사 결과와는 다르게 면역 블롯팅 검사에서는 모든 종양연관성 천포창 환자 혈청이 210 kD와 190 kD 단백과 반응을 하지만, 250 1:D와 230 kD 단백에는 일부 환자의 혈청만이 반응한다. 그러므로 종양연관성천포창의 주항원은 210 kD와 190 kD 단백이라 생각되며,또한 210 kD 단백이 현재까지 알려진 바와 다르게 DP Ⅱ가 아니라는 증거들이 있다.

본 연구에서는 종양연관성 천포창의 주항원으로 생각되는 단백의 항원 구조를 규명하기 위해 면역블롯팅 검사에서 210 kD단백과 190 kD단백에 양성을 보이며, Castleman종양을 동반한 종양연관성 천포창 환자의 혈청을 이용하여 사람 각질형성세포 λgt 11 cDNA library를 immunoscreening함으로써 환자의 IgG와 강하게 반응하는 단백을 생성하는 cDNA파아지 클론을 찾아내고 이를 종양연관성 천포창(PNP) 클론이라 명명하였다. 이 PNP클론에 대한 친화력을 이용하여 순수분리한 IgG는 간접면역형광검사에서 표피 각질형성세포 표면에

침착하였으며, 면역블롯팅 검사에서 210 kD 단백과 반응하였다. 이 PNP클론의 DNA를 분리하여 1.4 kb의 insert cDNA를 찾아내었고, 이 insert cDNA를 M13mp18 vector에 cloning하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과 210 kD 항원에 대한 항체와 결합하는 단백을 생성하는 PNP클론의 cDNA는 comified envelope의 전구물질로서 DP 유전자 가족에 속하는 envoplakin 유전자와 99.7% homology를 보였고, envoplaki 의 carboxy terminal C domain과 central rod domain 일부를 encode하는 것으로 밝혀졌다(nucleotides 5028∼6452). 또한 사람 각질형성 세포에서 PNP 클론 mRNA의 발현과 이의 크기를 알아보기 위해 Northern blotting을 시행한 결과, 약 6.5 kb의 hybridized band를 찾을 수 있었으며, 이의 크기는 envoplaki mRNA의 크기와 유사하였다. 이는 PNP클론 cDNA는 envoplakin 유전자의 일부분임을 시사한다.

이상의 결과로 종양연관성 천포창 항원 중 면역블롯팅 검사상 가장 흔히 검출되는 210 kD항원은 envoplaki 으로 생각되며, 종양연관성 천포창은 desmosome과 hemidesmosome에서 inter-mediate filament associated protein인 DP, 유천포창항원 1, envoplakin 등에 대한 자가항체를 생성하는 질환임을 알 수 있었다.

[영문]

Paraneoplastic pemphigus(PNP) is a rare acquired autoimmune blistering disorder characterized by severe mucosal erosions and polymorphous skin lesions in association with underlying neoplasia. Circulating auto-antibodies bind not only to the cell surface of stratified squamous epithelia but also to simple, columnar and transitional epithelia. These autoantibodies imunoprecipitate antigen complex of four polypeptides with molecular weight of 250, 230, 210, and 190 kD.

Although the 210 and 190 kD proteins are the most frequently detected antigens reacting with the sera of patients with PNP in immunoblot analysis, there is still uncertainty in the nature of these PNP antigen. In this study, the human keratinocyte cDNA library constructed to the λgt 11 expression vector was screened

by immunoscreening method with PNP patient's serum IgG purified by DEAE chromatography. This IgG recognized the 210 and 190 kD antigen in immunoblotting.

A single clone, named here the PNP clone, was isolated. Only the PNP patient's IgG, but none of IgG from a normal control, pemphigus foliaceus and pemphigus vulgaris patients, bound to the PNP clone. It was found that PNP IgG affinity purified by the PNP clone protein, but not unrelated clones, bound to the keratinocyte cell surfaces by immunofluorescence and reacted with the 210 kD PNP antigen in immunoblotting.

The cDNA of the PNP clone was approximately 1.4 kb. Sequencing analysis has revealed that insert cDNA of the PNP clone encodes a part of the central rod domain and the carboxyterminal C domain of envoplakin, a newly defined precursor of the cornified envelope that has homology to desmoplakin. In addition, in order to determine the mRNA expression of the PNP clone and its size, Northern blotting was performed. Approximately 6.5 kb hybridized band was detected and its size was similar to the full length of envoplakin cDNA suggesting that PNP clone is a partial cDNA of the envoplakin gene.

Above data demonstrates that the 210 kD PNP antigen might be the envoplakin and PNP is amautoimmune disease which produces autoantibodies against intermediate filament-associated proteins in desmosomes and hemidesmosomes: DP, bulbous pemphigoid antigen (BPAG 1) and envoplakin.