대장 직장암에서 apurinic/apyrimidinic DNA endonuclease 유전자의 발현

Abstract

[한글]

암은 세포 생물학적인 변환을 일으키는 여러 단계의 돌연변이에 의하여 발생한다. 대장 직장암은 adenomatous polyposis coli(APC), K-ras, hMSH2, hMLHl, p53 등 많은 유전자들의 돌연변이와 연관되며 이러한 돌연변이는 유전자의 손상으로부터 시작될 수 있다. 정상세포에는 유전자 손상을 복구하는 효소가 존재한다. 그러나 건피성 색소증(Xeroderma pigmentosa), 혈관확장성 운동실조증(Ataxia telangiectasia), Bloom 증후군 등에서는 복구효소의 선천적 장애로 인하여 암 발생율이 높다. AP DNA endonuclease(APE)는 고등동물에서 손상된 유전자를 복구하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 대장 직장암 조직에서 major human AP DNA endonuclease(APEX) 유전자의 변이와 발현에 관하여 알아보고자 하였다.

25명의 대장직장암 환자 조직으로부터 APE를 추출하여 효소 활성을 측정하였다. 또한 대장직장조직으로부터 염색체 DNA를 분리하고 이 DNA를 모형으로 하여 APEX 유전자에 대한 5가지의 시발자를 이용하여 PCR 방법으로 APEX 유전자의 cDNA 부분을 증폭하였다. 이렇게 얻은 PCR 산물을 direct sequencing을 시행하여 돌연변이를 검색하였다. 대장 직장암 조직에서 발현된 APEX를 검출하기 위하여 항-APEX 항체를 이용한 Western blot immunodetection과 면역조직화학법을 시행하였다. APEX에 대한 항원제조에 E. coli이 pGEX-4T-3 발현 벡터를 이용하였으며 이 벡터의 GST바로 다음부위에 APEX의 exon V 부분을 삽입하고 E. coli에서 발현시켜 GST-APEX5 융합 단백질을 합성하였다. 이 재조합 단백질을 토끼에 주사하여 항체를 제조하였다.

정상 대장 직장 조직의 APE 효소 활성도는 평균 65.7 EU/mg인데 반해 암조직에서는 21.7EU/mg으로 의의있게 감소되어 있었다. 특히 APEX 유전자에 점변이(point mutation)가 발견된 암조직에서는 APE의 효소환성이 현저하게 감소되어 있었다. 25예의 환자중 3예의 조직에서 APEX유전자의 점변이가 나타났고 이들 중 한 예에서는 두군데에 점변이가 있었다.

3예에서는 정변이(silent mutation)가 나타났으며 2예에서는 intron 2에서 염기치환이 한군데씩 있었다. 이들의 변이 형태는 대부분 C->T 흑은 T->C 전이(transition) 이였고 G->A 전이도 한군데에서 관찰되었다. 대장 직장암 조직에 발현된 APEX 단백질을 Western b

lot immunodetection으로 측정한 결과 암조직과 정상조직 모두에서 검출되었으며 큰 양적인 차이는 보이지 않았다. 또한 면역조직화학법을 이용한 APEX의 검출에서도 정상조직과 암조직 모두에서 이 효소가 주로 존재하는 핵내에서 발견되었으며 양적인 차이는 없었다.

결론적으로 APE의 활성도가 정상조직에 비하여 암조직에서 현저히 감소되어 있고 APEX유전자에 돌연변이가 있는 환자의 조직내 APE의 활성도가 더욱 감소되어 있는 것으로 보아 대장 직장암의 발암 과정에 APE 활성의 감소가 관여할 것으로 생각된다. 그러나 APEX의 변이 및 발현과 APE 활성사이에 양적인 상관관계가 없는 것으로 보아 대장 직장암 조직에는 또다른 형태의 APE 단백질이 존재하며 본 연구에서 사용한 항 AfEX 항체로는 모든 APE 단백질이 검출되지 못했음을 시사하고 있다. 따라서 또다른 형태의 APE단백질 검출과 이들의 상대적 활성도에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.

[영문]

Cancer may develop from multiple mutations of certain genes. In colorectal cancer, mutations are frequently found in APC, K-ras, hMSH2, hMLHl, and p53 genes. Mutations can be initiated from DNA injuries, but most cells have efficient repair mechanism to repair various types of lesions occurred. It has been known that cancer incidence is high in patients with Xeroderma pigmentosum, Ataxia telangiectasia, and Bloom's syndrome who have defects in gene repair mechanisms. These suggest that defects in gene repair enzymes may be involved in carcinogenesis. AP DNA endonuclease (APE) has been shown to be present in most prokaryotic and eukaryotic cells. This enzyme is reponsible for the excision repair of AP DNA and is required for the maintenance of the fidelity of genetic informations. The defect in AP DNA repair system may induce high mutational rate in the genome which may eventually lead to cellular aberration. In this study APE activity and mutational changes of a major human APE (APEX) gene as well as the expression of APEX protein in coloretal tissues were investigated.

Colorectal tissues were surgically removed from 25 colorectal cancer patients and the measurement of APE activities in the tissues and direct sequencing of PCR-amplified APEX gene covering the entire protein coding region were performed. In order to detect APEX protein expressed in colorectal tissues, GST-APEX5 fusion protein was expressed in E. coli using pGEX-4T-3 translation vector system. Expression of APEX protein was detected using Wetern blot immunodetection system and immunohistochemical analysis.

Mean APE activities in normal and tumor colorectal tissues were 65.7 EU/mg and 21.7 EU/mg, respectively. The enzyme activities were prominantly reduced in tumor tissues accompanied by the mutations of APEX gene. Point mutations in APEX gene were found in three patients and silent mutations were also found in three

patients. Base substitutions in intron Ⅱ were found in two patients. T->C or C->T transition was typical in most cases with some A->G transition. GST-APEX5 fusion protein was expressed in E. coli and was mainly present in the form of inclusion bodies. This fusion protein was injected into rabbit to produce anti-GST-APEX5 antibody. This antibody showed specificity to APEX protein, and was useful for the detection of APEX protein in colorectal tissues. APEX protein was detected in colorectal tissues of both normal and tumor tissues, and there was no significant difference in the amount of APEX protein between cancer and normal tissues. In conclusion, a significant reduction in APE activity in colorectal cancer tissues, especially in those with APEX mutations, indicates that the decreased enzyme activity might be related to the colorectal carcinogenesis. However, no quantitative correlation between APE activity and APEX protein expressed in the colorectal tissues implicates that the total enzyme activity might be originated from other forms of APE besides the APEX protein (major foam) detected by anti-GST-APEX5 antibody in the present study. Further studies are required for the detection and the measurement of relative activities encountered in other of APE in colorectal tissues.