이질아메바 병원성 분리주에서 발현되는 단백질을 coding하는 cDNA cloning

Abstract

[한글]

이질아메바 병원성 주와 비병원성 주를 대상으로 분자생물학적 방법을 사용하여 병원성과 관련있을 것으로 생각되는 유전정보를 찾고자 하였다. 병원성 분리주에서 특이적으로 발현되는 mRNA를 동정하고자 differential display reverse transcription-polymerase chain reaction(DDRT-PCR)을 수행하여 병원성 특이 증폭산물을 확인하고자 하였다.

한국인에서 검출한 이질아메바 병원성 분리주(YS-27)와 비병원성 분리주(S 16)로부터 정제한 mRNA를 주형으로 DDRT-PCR을 수행한 결과, 11개의 arbitrary primer와 3개의 one base anchored oligo-dT^^11 M(M: A, C, 또는 G)의 조합을 이용한 분석을 통해서 총 144개의 YS-27주 특이 분획을 확인할 수 있었다. 이 분획 중 biotin으로 표지한 DDRT-PCR증폭산물을 탐침으로 사용하는 DNA slot blot hybriazation에 의해 31개의 분획이 YS-27주에서만 증폭된 것으로 확인되었다 PCR에 의해 cysteine proteinase유전자의 일부를 증폭하여 탐침으로 사용한 DNA slot blot hybridization 분석을 실행한 결과, 확인된 31개의 분획 중에서 21개의 분획이 cysteine proteinase 유전자에서 발현된 mRNA로부터 증폭된 것임을 확인할 수 있었다. 그리고 YS-27주로부터 제작된 cDNA library를 YS-27주 특이 DDRT-PCR 증폭산물로 확인된 31개의 증폭산물 중에서 8개를 임의로 선택하여 탐침으로 사용하는 DNA hybridization법으로 검색한 결과 7개의 단일 clone을 동정하였으며, 확인된 clone 중 cysteine proteinase 유전자에 의해 검색된 3개 clone을 제외한 4개의 clone을 이용해서 immunoscreening을 수행한 결과, 이들 4개 clone들이 이질아메바 감염자 혈청파 반응하는 단백질을 coding하고 있는 clone임을 확인하였다.

[영문]

The differential display reverse transcription polymerase chain

reaction(DDRT-PCR) analysis was performed to identify the pathogenic strain specific amplicons which were amplified from the mRNAs related to pathogenicity of Entamoeba histolytica. mRNAs were purified from the trophozoites of the pathogenic strain YS-27and the non-pathogenic strain S 16 respectively. Three kinds of first stranded cDNAs were inverse transcribed from the mRNAs by one base anchored oligo-dT^^11 M(M: A, C, or G) pimers. Each cDNA template was used for DDRT-PCR analysis. A total of 144 pathogenic strain specific amplicons were observed in DDRT-PCR analysis using primer combinations of the 11 arbitrary primers and the 3 one base anchrked oligo-T^^11 M primers. Thirty-one of the 144 pathogenic strain specific amplicons were verified as the amplicons amplified only from the mRNAs of the pathogenic strain by the comparison of DNA slot blot hybridization patterns using biotin labeled probes of the pooled DDRT-PCR products from the pathogenic and the non-pathogenic strain respectively Further characterization of the 31 pathogenic strain specific amplicons by DNA slot blot hybridization analysis using biotin labeled probes of the PCR amplified DNA of cysteine proteinase genes revealed that 21 of them were amplified from the nRNAs of Ihe cysteine proteinase genes. Four randomly selected amplicons out of the rest 10 amplicons were used for screening of cDNA libary followed by immunoscreening and all of them were tumid out to be amplified from the mRNA coding protein.