Saxatilin의 돼지 맥락막 모세혈관 내피세포와 동물모델에서 맥락막 신생혈관에 미치는 억제효과

Abstract

[한글]연령관련황반변성은 노년인구의 주된 실명원인으로서 특히 습성 연령관련황반변성에서의 맥락막신생혈관에 의한 망막파괴가 특징이다. 혈관신생과정에서 integrin은 내피세포의 부착, 이동, 증식에 중요한 역할을 한다. Saxatilin은 한국산 칠점사(Glydius saxatilis)에서 유래한 disintegrin으로서 RGD 서열을 포함하고 있기 때문에 αvβ3 integrin과 결합함으로서 이를 경쟁적으로 억제한다. 본 연구는 saxatilin을 사용하여 맥락막 모세혈관 내피세포와 쥐에서 실험적으로 유발된 맥락막 신생혈관에 대한 억제효과를 알아보고자 하였다. 실험은 크게 두 가지로 진행되었다. 먼저 돼지 눈으로부터 맥락막 모세혈관 내피세포를 일차 배양하고 그 특성을 분석한 뒤 saxatilin을 농도 별로 처리하여 내피세포의 부착, 이동 및 증식을 억제하는 정도를 측정하였으며, trypan blue dye exclusion test 및 cell counting kit 8으로 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보았다. 250g 내외의 Brown Norway Rat 30마리의 양안에 파장 532 nm, 강도 150 mW, 크기 60 μm, 시간 50 ms 의 설정으로 각 눈에 6-8개의 레이저반을 만들어서 맥락막 신생혈관을 유발하였고, 10마리씩 세 군으로 나누어 balanced salt solution (control), saxatilin 3 μg, 15 μg을 각각 유리체강 내에 주사하였다. 2주 뒤 형광안저혈관조영술을 시행하여 형광누출의 세기를 측정하여 세 군을 비교한 후, 안구를 적출하고 고정하여 조직검사를 통해 맥락막 신생혈관의 크기를 비교하였다. Saxatilin 12.5 μg/ml에서 500 μg/ml 사이에서 농도에 비례하여 일차배양된 맥락막 모세혈관 내피세포의 부착 및 이동을 억제하였으며 (p<0.05), 100 μg/ml이상의 농도에서 내피세포의 증식을 완전히 억제하였다. 500 μg/ml 농도까지는 세포 생존률의 변화는 없었다. 쥐에서 유발된 실험적 맥락막 신생혈관에 대해서도 농도에 비례하여 신생혈관의 활동성을 억제함을 형광안저혈관조영술을 통해 확인하였고 (1.06±0.08 vs 0.74±0.02 vs 0.68±0.01; p<0.05), 신생혈관의 증식을 억제함을 조직학적 소견을 통해 확인하였다 (82.85±1.29 vs 58.18±1.55 vs 46.02±2.47 μm; p<0.05). 망막의 각 층의 두께나 세포의 모양 등을 대조군과 비교해보았을 때, 실험군에서 saxatilin의 세포독성을 의심케 하는 소견은 관찰되지 않았다 결론적으로 saxatilin은 돼지 맥락막 모세혈관의 부착, 이동 및 증식을 억제하였고 쥐 모델에서 맥락막 신생혈관을 효과적으로 억제하였는데, 이는 맥락막 신생혈관의 예방 및 치료제로서 saxatilin의 임상적 사용 가능성을 제시해준다.

[영문]Age related macular degeneration is the leading cause of blindness in patients over the age of 65 years, with the neovascular (exudative) form accounting for more than 80% of the cases with severe visual loss. Choroidal neovascularization (CNV) is a result of pathologic angiogenesis, which is partially mediated by the alteration of integrin expressions. Integrins are transmembrane receptors that stabilize the cell attachment to the extracellular matrix and regulate cell survival and proliferation. Integrin αvβ3 is selectively expressed in the CNV. Disintegrins are a family of cystein-rich, low molecular weight proteins that are found in various snake venoms. Saxatilin, isolated and characterized from the venom of a Korean snake, Gloydius saxatilis, is a single-chain polypeptide composed of 73 amino acids, including 12 cysteins, as well as the tripeptide sequence Arg-Gly-Asp, a proposed recognition site of integrins. Like other integrins, saxatilin strongly inhibits human platelet aggregation, bFGF-induced proliferation of HUVEC, and vitronectin-induced migration of smooth muscle cells. It also regulates platelet activation associated with HUVEC migration and invasion, suppresses TNF-α-induced ovarian cancer cell proliferation and invasion, and inhibits angiogenesis and tumor progression.

The aim of this study was to investigate the suppressive effect of saxatilin on adhesion, migration, and proliferation of choriocapillary endothelium, which plays a critical role in CNV, and to evaluate inhibitory effect on experimental choroidal neovascularization in rats.

Primary porcine choriocapillary endothelial cells (CECs) were obtained from fresh porcine eyes. CECs were isolated using superparamagnetic beads (Dynabeads) coated with the endothelial cell-specific lectin Lycoperisicon esculentum, which selectively binds to fucose residues on the endothelial cell surface. Isolated cells were confirmed to be endothelium by its cobblestone morphology, over 99% immunoreactivity to von Willebrand factor and tube formation. Saxatilin inhibited the adhesion of CECs to fibronectin-coated plates and the migration through fibronectin-coated transwell membrane in a dose-dependent manner. Also, it completely suppressed the proliferation of CECs in 100 μg/ml concentration. Through trypan blue dye exclusion test and CCK-8, it showed no effect on cell viability at the concentration up to 500 μg/ml.

CNV were induced by laser photocoagulation (532 nm wavelength, 150 mW, 60 μm, 50 ms) in both eyes of 30 adult Brown Norway rats, followed by intraviteal administration of single dose of saxatilin of 0 μg (n=10), 3 μg (n=10), or 15 μg (n=10). On fluorescein angiogram 14 days after CNV induction, there was a dose-dependent decrease in fluorescein leakage of saxatilin-treated groups compared with control group (1.06 ± 0.08 vs. 0.74 ± 0.02, vs. 0.68 ± 0.01; p<0.05). Histologically, the thickness of the CNV lesions was significantly (p<0.05) reduced in eyes that received saxatilin (82.85 ± 1.29 vs. 58.18±1.55 vs. 46.02±2.47 μm). There was no noticeable change in retinal morphology, thickness and cell morphology.

In conclusion, saxatilin effectively inhibited adhesion, migration and proliferation of porcine CECs, and suppressed CNV progression in rat model of laser induced CNV, suggesting that this disintegrin may be beneficial agent in the prevention and treatment of CNV.