VEGF trap을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 항종양효과

Abstract

[한글]신생 혈관 형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 자라나는 과정을 말한다. 종양 조직은 2~3 ㎜ 이상 성장하기 위해서 종양 내부의 저산소증을 극복하기 위한 산소와 영양소의 공급이 필수적이기 때문에 이를 위한 무절제한 신생 혈관 형성이 지속적으로 이루어 진다. 종양 내 신생 혈관 형성을 매개하는 여러 유도 물질 중 Vascular endothelial growth factor(VEGF)는 가장 중추적인 역할을 하며 VEGF가 중재하는 신생 혈관 형성은 종양의 성장 및 침윤에 중요한 역할을 하기 때문에 항암 치료에 있어서 매력적인 표적이 되고 있다. VEGF trap은 사람의 IgG의 Fc 부위와 VEGF 수용체인 VEGFR1과 VEGFR2의 VEGF 결합 도메인을 융합시킨 수용성 VEGF 특이적 decoy receptor로써 종양에서 과다하게 분비하는 VEGF에 특이적으로 결합하여 VEGF의 농도를 효과적으로 낮춤으로서 종양 내 신생 혈관 형성을 억제시킬 수 있다. 본 연구에서는 종양 신생 혈관 형성에 가장 중요한 인자로서 영향을 미치는 VEGF를 효과적으로 억제 할 수 있는 VEGF 특이적 수용성 decoy receptor인 KH903을 유전자 전달 효율이 높은 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 삽입하여 이용하였다. 아데노바이러스의 E1부위에 lacZ를 표지 유전자로 도입하고 E3 부분에 KH903을 발현하는 복제 불능 아데노바이러스를 제작하여 6종류의 폐암 세포주에 감염시키고 배지를 수거하여 VEGF 발현 억제 정도를 VEGF ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하여 확인한 결과 실험에 이용한 모든 세포주에서 VEGF양이 확연하게 감소함을 관찰할 수 있었다. 이어서 VEGF 발현 억제로 인한 혈관 내피 세포 증식능의 감소, 이동능력의 감소를 proliferation assay와 migration assay를 통하여 관찰 하였고, 분화 능력의 감소와 vessel sprouting 감소를 tube formation assay와 aorta ring sprouting assay를 통하여 확인 할 수 있었다. 이와 더불어 아데노바이러스의 E1B 유전자가 소실되고 E1A의 Rb와의 결합능이 소실되고 E1B가 제거된 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 RdB의 E3 부위에 KH903을 삽입하여 제작한 RdB/KH903을 이용하여 H460 xenograft model에서 뛰어난 생채 내 항종양 효과를 확인하였다. 이어서, 혈관 내피세포 표지 인자인 CD31 발현 정도 확인을 통하여 KH903의 종양 조직 내 신생 혈관 억제 효과도 검증할 수 있었다. 결과적으로 VEGF 특이적 decoy receptor인 KH903을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 바이러스 자체의 암세포 특이적 복제 및 살상을 유도할 뿐만 아니라 E1A 발현과 KH903의 발현으로 유도된 VEGF 발현 억제로 인해 상승적 항종양 효과를 보이는 RdB/KH903은 항암치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이라 생각된다.

[영문]Angiogenesis, the formation of new blood vessels from

pre-existing vessels, is tightly regulated by balancing between

inducer and suppressor of angiogenesis in normal tissues. Tumor

vessels have features that the formation of vessels are leaky and

irregular because unregulated angiogenesis is generated to supply

oxygen and nutrient for growth and invasion during tumor growth.

Therefore, VEGF which plays a pivotal role in angiogenesis can be

an attractive target for anti-cancer therapy.

VEGF Trap is a soluble VEGF decoy receptor that is comprised of

the second immunoglobulin-like domain of human VEGFR1 and the

third immunoglobulin-like domain of human VEGFR2 linked to the

constant region (Fc) of human IgG1. KH903 has an additional extracellular domain 4 of VEGFR2 (KDRd4) which can increase

binding affinity with VEGF. To express this potent VEGF blockade

continuously, we used a vector based on delivery system such as

recombinant viral vectors. Replication-incompetent adenovirus

expressing KH903, dE1-k35/KH903, induced anti-angiogenesis

through down regulation of VEGF. It was verified using hVEGF

ELISA, HUVEC proliferation assay, migration assay, tube formation

assay and rat aorta sprouting assay. In addition, RdB-KH903 showed

enhanced anti-tumor effect in comparison to its congnate control

oncolytic adenovirus, RdB, in H460 tumor xenograft model.

Furthermore, vessel density in tumor tissue treated with RdB/KH903 was greatly reduced compared to that in tumor treated with RdB.

In conclusion, these data showed that the newly generated

adenovirus expressing KH903 could be effective cancer therapeutic

oncolytic adenovirus to exert its down-regulation of VEGF level

secreted from cancer cells.