The regulatory mechanism of TNF-α-stimulated S100B expression and the inhibitory role of intracytoplasmic HMGB1 in NF-κB-mediated TLR3 signaling

Abstract

[한글]S100B와 HMGB1 분자는 동일한 수용체인 RAGE에 대한 리간드로

알려져 있으며, 여러 세포 주에서 이러한 수용체를 매개로

염증반응에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 첫째, 대표적인 염증

사이토카인의 하나인 TNF-α에 의한 S100B 단백질의 발현조절 기전을

규명하고, 둘째 TLR3 수용체를 매개로 이루어지는 NF-κB 활성을

억제하는 HMGB1의 새로운 기능을 밝혔다. S100B 단백질은 주로

중추신경계내 성상세포에서 발현되며, 특히, 신경퇴행적장애를 겪는 환자의 경우 S100B의 분비 수준이 매우 높다고 보고 되었다. 따라서,

S100B의 발현조절 연구는 이러한 뇌 질환에 대한 이해를 높이는데

매우 중요할 것으로 기대된다. 사람의 성상세포 U373을 TNF-α로

처리한 결과 S100B의 mRNA, 단백질 발현 수준이 모두 감소함을

발견했다. 그리고 이러한 감소는 S100B promoter region내에 위치하는

Sp1 binding site에 대한 전사조절인자 Sp1의 결합 억제에 의한 것임을

확인했다. 또한 TNF-α 자극은 HDAC-1과 Sp1의 결합으로

증가시킴으로 Sp1 단백질의 결합을 억제하는 것으로 나타났다.

따라서 TNF-α에 의한 S100B 발현조절은 전사조절인자, Sp1을 통해

이루어짐을 밝혔다.

HMGB1 단백질은 DNA에 결합하는 핵 단백으로 처음 알려졌으며,

거의 모든 세포에서 발현된다. 먼저 TLR3 수용체가 과발현되는

세포주(HEK293-hTLR3)를 대상으로 HMGB1단백을 과잉발현 시킨 후,

TLR3 수용체의 리간드인 poly(I:C)를 처리하여 TLR3 수용체를 통한

신호전달을 조사하였다. 그 결과, HMGB1은 특이적으로 poly(I:C)에

의한 NF-κB 활성을 억제하였으며, 이러한 억제는 HMGB1 단백 농도

의존적임을 밝혔다. 또한 TLR4 와 MD2 단백질을 과발현하는 세포주

(HEK293-hTLR4/MD2)를 LPS로 처리하였을 때도 동일한 결과를

나타냈다. 과발현된 HMGB1 단백은 poly(I:C)에 의한 IκBα의 인산화를 부분적으로 감소시켰다. 야생형 HMGB1, C-말단이 제거된 HMGB1은 세포 내 p65단백질과 결합함을 보였고, poly(I:C) 처리 후, p65의 핵내로의 이동은 세포질 내 HMGB1 (cytoplasmic HMGB1) 단백 발현의 증가에 의하여 감소하였다. 이러한 결과는 세포질 내에서 poly(I:C) 처리 후, HMGB1과 p65의 증가된 결합을 면역침강법과 공초점 현미경을 통해 재확인되었다. HEK293-hTLR3 세포주에서

전사조절인자 p65가 여러가지 karyopherin 단백과 결합함을

확인하였으며, HMGB1은 p65와 karyopherin α3 및 α5의 결합을

억제함을 확인하였다. 이상의 결과로 세포질내 HMGB1은

세포신호전달에서 NF-κB의 활성을 억제하여 세포의 신호전달

조절에 관여함을 제시하였다.

[영문]It has been known that Receptor Advanced Glycation End product (RAGE) is a member of the immunoglobulin superfamily of cell surface proteins interacting with a range of ligands, including advanced glycation end products (AGE), amyloid- peptide, HMGB1 and S100B. S100B and HMGB1 proteins are known to be physiological ligands for RAGE in migratory and inflammatory cellular responses.Here, we report two results (1) the mechanism by which TNF-α represses the S100B expression via Sp1. (2) The negative role of intracytoplasmic HMGB1 in NF-κB-mediated TLR3 signaling.S100B, a calcium-binding protein predominantly produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS), takes part in the development of the brain and in neurodegenerative disorders. The serum level of TNF-? is elevated in the brain disease. In this study, we found that TNF-? repressed S100B expression in primary human astrocytes and U373 astrocytoma cells dose- and time-dependently. Transcriptional repression of S100B gene by TNF-? was not affected by cycloheximide or NF-?B inhibitors, but was abrogated by treatment with two GC-rich DNA-binding protein inhibitors, mithramycin A and its analog, chromomycin A3. Transcription of S100B promoter lacking the Sp1 binding site (pGBS?-168/+697) was increased by TNF-? treatment, suggesting that Sp1 is involved in the repression of S100B transcription by TNF-α. Furthermore, an electrophoretic mobility supershift assay showed that Sp1 binding was reduced by treatment with TNF-α. These results suggest that the repression of S100B expression by TNF-α is mediated by Sp1.High mobility group box protein 1 (HMGB1), a nuclear DNA-binding protein, is present in almost all eukaryotic cells. We show that HMGB1 inhibits poly(I:C)-induced NF-κB but not ISRE (the interferon-stimulated response element of the IFNA/B-inducible gene) activation. Furthermore, HMGB1 inhibits NF-κB activity in dose dependent manner, in both TLR3 and TLR4 table cell line. Cytoplasmic HMGB1 inhibits phosphorylation of IκBα but did not affect that of IRF-3. When we treated cells with poly(I:C), phosphorylation of ERK level was decreased in HMGB1-tranfected cells. These date suggest that HMGB1 specifically inhibits poly(I:C)-mediated NF-κB. Cytoplasmic HMGB1 decreased p65 translocation into the nucleus. Furthermore, ectopic HMGB1 did also increase the binding to p65 in the cytosol. After poly(I:C) treatment, p65 strongly bind to all types of karyopherins and karyopherin α3/α5 were bound to endogenous HMGB1 at the that time. In competition assay, increasing amount of recombinant HMGB1 decreased the binding of p65 and karyopherin α3/α5. Overall our data indicated that HMGB1 inhibits poly(I:C)-mediated TLR3 signaling.