The impact of translationally controlled tumor protein on the podocyte hypertrophy under diabetic conditions

Abstract

[한글]배경: 세포 비후 과정은 세포 주기 조절 단백 중 주로 cyclin-dependent kinase 억제제 (CKIs)의 발현 증가와 밀접하게 연관되어 있다. 최근의 연구에 의하면, CKIs 이외에도 mammalian target of rapamycin (mTOR)와 같은 mRNA 전사를 조절하는 세포 신호 전달계의 활성화도 세포 비후를 유발시키는 것으로 보고되고 있다. Translationally controlled tumor protein (TCTP)은 대부분의 진핵세포에 잘 보존된 상태 (conserve)로 존재하며, mRNA 전사 조절 과정을 통하여 세포 증식 및 비후 등 다양한 세포 내 현상과 관련이 있을 것으로 생각되어 왔다. 당뇨병성 신병증의 병리학적 특징 중 하나가 사구체 비후이기 때문에, TCTP와 당뇨병성 신병증의 발생 사이에 연관이 있을 가능성이 있으나, 이에 대한 연구는 전무한 실정이다. 이에 본 연구자는 고포도당으로 자극한 족세포와 실험적 당뇨 사구체에서 TCTP의 발현 변화를 관찰하였으며, 당뇨 조건 하에서 TCTP가 족세포의 비후에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.

방법: 생체 내 실험으로는 불멸 생쥐 족세포를 정상 포도당군 (5.6 mM), 정상 포도당+만니톨군 (24.4 mM), 정상 포도당+안지오텐신 II 군 (10-6 M), 고포도당군 (30 mM), 그리고 고포도당+L-158,809 처치군 (10-7 M)으로 나누어 배양하였으며, TCTP 발현 억제를 위하여 TCTP shRNA를 포함한 lentivirus로 전처치한 실험도 시행하였다. 생체 내 실험으로는 32마리의 C57BL/6 생쥐를 사용하였으며, 16마리는 대조군, 그리고 16마리는 streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 당뇨군으로 나누었고, 각 군에서 8마리씩은 TCTP shRNA를 포함한 lentivirus로 처치하였다. 배양 족세포 및 분리한 사구체 내 TCTP mRNA의 발현은 real-time PCR으로, TCTP, phospho-4EBP1, 4EBP1, phospho-p70S6K, p70S6K, p27, p21, 그리고 β-actin의 단백 발현은 Western blot을 이용하여 분석하였다. 사구체 내 TCTP 단백의 발현 위치는 synaptopodin과 TCTP을 이용한 이중 면역형광염색으로 관찰하였다. 족세포 비후는 단백량/세포 수 및 유세포 분석으로, 그리고 사구체 비후는 morphometry를 이용하여 확인하였다.

결과: TCTP mRNA 및 단백의 발현은 정상 포도당군에 비하여 고포도당에서 의미있게 증가되었으며, 고포도당군에서의 TCTP 발현 증가는 L-158,809에 의하여 의의있게 억제되었다. 안지오텐신 II 역시 배양 족세포에서 TCTP의 발현을 유의하게 증가시켰다. 사구체 내 TCTP의 발현도 대조군에 비하여 당뇨군에서 의미있게 증가되었으며, 이중 면역형광염색상 당뇨 사구체 내 TCTP의 발현 증가는 주로 족세포의 발현 증가에 기인함을 확인하였다. 생체 내 및 생체 외 실험상 TCTP shRNA를 포함한 lentivirus로 처치한 경우 당뇨 조건 하에서 phospho-4EBP1, phospho-p70S6K, 그리고 p27의 단백 발현 증가뿐만 아니라 족세포 및 사구체 비후가 유의하게 억제되었다.

결론: 당뇨 조건 하에서 족세포 내 TCTP의 발현이 증가되었으며, TCTP 억제를 통하여 당뇨 조건 하에서 세포비후와 관련된 4EBP1과 p70S6K의 활성화 및 CKIs의 발현 증가와 함께 족세포 비후가 의미있게 억제되었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, TCTP는 mRNA의 전사 조절과 세포 주기의 진행 억제를 통하여 당뇨 조건 하에서의 족세포 비후에 관여할 것으로 생각된다.

[영문]Background: Hypertrophic mechanism requires cell cycle arrest at the G1/S interphase, which is principally mediated by inhibitors of cyclin-dependent kinase (CDK), namely CDK-inhibitors (CKIs). In addition to CKIs, recent studies have shown that activation of mRNA translation regulating signaling pathways such as mammalian target of rapamycin (mTOR) is also implicated in cellular hypertrophy in various diseases. Translationally controlled tumor protein (TCTP) is highly conserved in eukaryotic cells and has been suggested to be involved in various intracellular processes including cell proliferation and growth by regulating mRNA translation pathway. Since glomerular cells hypertrophy is a characteristic finding in diabetic nephropathy, there is a possibility that TCTP may play an important role in the pathogenesis of diabetic nephropathy. However, the functional role of TCTP on cellular hypertrophy under diabetic conditions has never been explored. In this study, I examined not only the changes in TCTP expression in high glucose-stimulated podocytes and in experimental diabetic glomeruli but also the impact of TCTP on podocyte hypertrophy under diabetic conditions.Methods: In vitro, immortalized mouse podocytes ether with or without transfection of TCTP shRNA expressing lentivirus were serum restricted for 24 hr, after which the medium was changed to RPMI medium containing 5.6 mM glucose (NG), NG+24.4 mM mannitol (NG+M), NG+10-6 M angiotensin II (NG+ANG II), 30 mM glucose (HG), or HG+10-7 M L-158,809 (HG+ARB). In vivo, 32 C57BL/6 mice were injected either with diluent (n=16, C) or streptozotocin intraperitoneally for 5 consecutive days (n=16, DM). Eight mice from each group were treated with lentivirus containing TCTP shRNA (LV-shTCTP). Real-time PCR for TCTP mRNA expression and Western blotting for TCTP, phospho-4EBP1, 4EBP1, phospho-p70S6K, p70S6K, p27, p21 or β-actin protein expression were performed with cell lysates and sieved glomeruli. Double immunofluorescence (IF) staining with synaptopodin and TCTP was also performed with renal tissue. Podocyte hypertrophy was assessed by measurement of cellular protein/cell counts and by flow cytometry, and glomerular volume by morphometry.Results: Compared to NG cells, TCTP mRNA and protein expression were significantly increased in podocytes exposed to HG for 48 hrs, and this increase in TCTP expression was abrogated by ARB treatment. Similarly, ANG II induced TCTP mRNA and protein expression in cultured podocytes. Glomerular TCTP expression was also significantly higher in DM compared with C mice. Double IF staining for TCTP and synaptopodin revealed that podocytes were the main cells responsible for the increase in TCTP protein expression under diabetic conditions. TCTP inhibition using LV-shTCTP ameliorated the increase in phospho-4EBP1, phospho-p70S6K, and p27 protein expression in high glucose-stimulated podocytes and in diabetic glomeruli along with reduced podocyte and glomerular size.Conclusion: I demonstrate for the first time that TCTP expression is increased in podocytes under diabetic conditions and that inhibition of TCTP attenuates the activation of mTOR target molecules, 4EBP1 and p70S6K, and CKIs expression, along with reduced podocyte and glomerular size. These findings suggest that TCTP may play an important role in the process of podocyte hypertrophy under diabetic conditions via regulating mRNA translation and inducing cell cycle arrest at the G1/S interphase.