사람 간암세포주에서 과발현된 hexokinase II의 호기해당작용에서의 역할 및 항세포사멸과 연관된 PI3K/Akt 경로에 미치는 효과

Abstract

[한글]

Hexokinase II (HK II)는 악성종양에서 호기해당작용에 핵심적인 반응조절 효소이다. 세포의 증진된 해당작용을 반영하는 F-18 FDG 섭취의 증가는 간세포암의 악성도와 불량한 예후와 관련이 있으며, 악성도가 높은 암일수록 F-18 FDG섭취가 높다. 간암세포의 경우 HK II는 정상세포보다 100배 이상 증가되어 있다. HK II는 porin과의 복합체 상태 [HK- voltage dependent anion channel (VDAC)-adenine nucleotide translocator (ANT) complex]로 미토콘드리아에 결합하여 미토콘드리아 내 산화성 인산화와 포도당 해당과정을 원활히 연결시키며, 이 때 생성된 ATP와 포도당 분해산물이 암세포 분열에 필요한 에너지와 물질을 제공한다. VDAC-ANT 결합체가 미토콘드리아 투과성변이(mitochondrial permeability transition)와 세포사멸 인자의 방출을 조절하고, HK II가 세포사멸 통로를 조절하는 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한 HK II가 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt 신호전달 경로를 조절하여 항세포사멸 작용을 나타내는 것으로 보고되었으나, 간암세포에서 HK II의 Akt 관련 항세포사멸 작용의 분자생물학적 기전은 정립되어 있지 않다.

본 연구에서는 HK II의 역할에 핵심적인 세포 내 미토콘드리아와의 결합과 포도당 인산화 과정을 밝히기 위하여 HK II 발현이 적은 간암세포인 SNU-449세포주와 정상 간세포로 알려진 Chang세포주에 HK II 유전자를 이입(transfection)시켜 해당작용과 이에 관련된 유전자 발현을 분석하고 항암제에 대한 항세포사멸 효과를 관찰하였다. 또한 과발현된 HK II의 항세포사멸 작용과 관계된 세포 내 신호전달분자를 규명하기 위하여 PI3K/Akt 경로에 작용하는PI3K 억제제를 처리하여 항세포사멸 작용의 기전을 밝히고자 하였다

HK II가 저발현된 SNU-449 세포주와 정상 간세포인 Chang 세포주에 재조합 HK II를 이입시켜 HK II 과발현 SNU-449 간암세포주(SNU-449-HK II)와 Chang 세포주(Chang-HK II)를 확립하여 HK II의 발현과 기능을 RT-PCR, western blot 분석, ATP와 lactate 생성, F-18 FDG 섭취, 면역형광분석법으로 조사하여 이입된HK II가 효과적으로 발현되고 기능함을 확인하였다. 세포 생존능과 항암제에 대한 감수성 평가는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 이용한 세포계산법으로 측정하였다. 또한 종양의 악성도와 관계되는 신호전달분자로 PI3K/Akt경로를 연구하였다.

HK II를 과발현하는 SNU-449-HK II와 Chang-HK II에서 HK II가 높게 발현되었지만 포도당 대사에 관여하는 다른 유전자, 즉 HK I, HK III, glucose transporter-1, -2, glucose-6-phosphatase의 발현은 변화하지 않았다. 세포 내 에너지 감지장치인 AMP-activated protein kinase (AMPK)는 SNU-449-HK II에서 낮은 발현을 보였고, 24시간 경과 후 ATP양이 20% 증가하였으며 lactate 생성량이 45% 증가하여 AMPK저하에 ATP증가가 관여하였음을 확인하였다. HK II의 작용 부위를 알아보기 위하여 면역형광시험법을 시행하여 과발현된 HK II의 분포 위치가 세포 내 미토콘드리아와 일치되는 것을 관찰하였다. 그러나 HK II가 결합하는 미토콘드리아의 VDAC은 그 발현도가 변하지 않았다. SNU-449-HK II에서 F-18 FDG 섭취가 대조군에 비하여 54% 증가하였고, 배양 3일 후 세포증식이 1.5~2.0배 항진되었다(p<0.005). SNU-449-HK II에10 μg의 cisplatin을 처리한 결과 약물에 대한 감수성이 저하되었다. PI3K/Akt의 신호전달분자인 활성 Akt (p-Akt)가 SNU-449-HK II에서 대조군에 비하여 상당히 증가하였고, PI3K 억제제인 50 μM의 NY294002로 처리한 후 p-Akt가 거의 소실되었다. PI3K 억제제 투여 후 세포 내 전체 HK II의 양은 변화하지 않았으나 미토콘드리아 구획 HK II가 현저히 감소하고 세포질 구획 HK II는 증가하여 미토콘드리아에 결합한 HK II가 세포질로 전위함을 확인하였다.

결론적으로 사람 간암세포주에서 HK II의 과발현과 세포 내 해당작용 및 세포사멸에 관련된 신호전달체계의 관계를 분석하여, HK II가 호기해당작용에 결정적인 반응조절효소로서 간암세포의 악성도와 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었다. HK II는 미토콘드리아에 결합하여 PI3K/Akt 신호전달체계와 연계되어 간암세포의 성장과 증식, 항암제에 대한 감수성 저하 등 항세포사멸 작용에 중요한 역할을 담당하는 것을 확인할 수 있었다.

[영문]Hexokinase II (HK II) plays a critical role and rate limiting enzyme in aerobic glycolysis. Most malignant cells obtain their ATP by metabolizing glucose directly to lactic acid, even in the presence of oxygen. Many malignant cells display increased F-18 FDG uptake reflecting enhanced glycolytic activity. Hepatocellular carcinoma (HCC) cells have been shown to exhibit very high concentrations of HK II more than 100-fold normal. F-18 FDG uptake is increased in high grade and poorly differentiated hepatocellular carcinoma, and known to be a prognostic marker. HK II binds to the mitochondrial outer membrane as a form of HK II-voltage dependent anion channel (VDAC)-adenine nucleotide translocator (ANT) complex, and mitochondrial oxidative phosphorylation is closely coupled to the glycolytic pathway via direct channeling. Energy production in the form of ATP and glycolytic metabolites supports cancer cell growth. Recently, HK II-VDAC-ANT complex has been reported to regulate mitochondrial permeability transition and pro-apoptotic protein release. Mitochondrially bound HK II plays a role in anti-apoptotic effect, and growth factors and Akt require glucose to prevent apoptosis and promote cell survival. However the molecular mechanism is not clarified as to Akt regulated pathway and mitochondrial HK II association.

In order to evaluate the role of mitochondrially bound HK II and the molecular pathway related to anti-apoptosis in HCC, two HK II overexpressing stable cell lines were established by transfection of full length DNA of HK II to a HCC cell line that expresses low level of HK II (SNU-449 cells) and a normal hepatic cell line (Chang cells). The roles of overexpressed HK II in elevated aerobic glycolysis, cellular proliferation, anti-apoptotic effect were examined. The effect of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor was also examined to evaluate PI3K/Akt pathway related to anti-apoptosis induced by overexpressed HK II.

The HK II genes were stably transfected to SNU-449 cells and Chang cells with expression vector. The HK II expression and its functions in these cells were determined by RT-PCR, western blot analysis, ATP and lactate production, F-18 FDG uptake measurement and confocal microscopy. The cellular proliferation activity and response to an anticancer drug, cisplatin, were evaluated by cell counting using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. For the evaluation of molecular pathway involved in cell proliferation, PI3K/Akt pathway was investigated.

The stable cell lines of SNU-449 HK II and Chang-HK II expressed HK II effectively, but other enzymes or transporters for glycolysis, glucose transport and gluconeogenesis such as HK I, HK III, glucose transporter-1, -2, and glucose-6-phosphatase did not show any change. The cellular energy sensor, phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK) expression was decreased in SNU-449-HK II. The production of ATP and lactate was also increased by 20% and 45%, respectively, following incubation for 24 hours, reflecting elevated glycolytic activity. The site of overexpressed HK II was associated with mitochondria on confocal microscopy. The F-18 FDG uptake value was increased to 54% in SNU-449-HK II cells, compared with control cells. Cell growth and proliferation analysis showed that cell growth rate was markedly increased compared to control, by 1.5~2.0 folds (p<0.005). After treatment of an anticancer drug, cisplatin, HK II overexpressed cells showed decreased susceptibility compared to control group (p<0.005). In molecular study to confirm HK II regulation mechanism, the activated form of Akt (p-Akt) was increased after transfection, but the p-Akt activity was much decreased following PI3K inhibitor (NY294002) treatment. PI3K inhibitor had no effect on cellular total HK II, but HK II was translocated from the mitochondria to the cytoplasm, and so it was demonstrated that overexpressed HK II induced PI3K/Akt pathway.

This study represents that HK II has an important role in malignancy as a result of analysis of molecules and products related to aerobic glycolysis and anti-apoptosis. Also, HK II is bound to mitochondria, and closely related to PI3K/Akt signal pathway in hepatocellular carcinoma, which suggests that these molecular mechanisms could play a key role in unsuppressed growth of tumor cells, inhibition of cell death and decreased susceptibility to the anticancer drug.