Neuroprotective effects of α-tocopherol and α-tocotrienol on kainic acid-induced neurotoxicity in organotypic hippocampal slice cultures

Abstract

[한글]Kainic acid(KA)는 kainate 수용체와 AMPA 수용체에 작용하는 흥분성 신경독소 물질로 이온성 수용체들을 활성화시켜, 막전위의 이온 불균형을 초래하여 세포 내 칼슘이온 농도를 증가시켜 활성 산소종을 생성하게 된다. 활성 산소종은 뉴런내의 고분자들을 공격하여 세포막 lipid peroxidation, 단백질의 구조적, 기능적 변화와 DNA strand 파괴 등을 유발한다. α-tocopherol(ATPH)과 α-tocotrienol(ATTN)과 같은 vitamin E는 lipid peroxidation 과정 중의 연쇄적인 진행 단계를 저지하는 항산화제이다. 본 연구에서는 organotypic hippocampal slice culture(OHSC) 모델을 이용하여 ATPH 와 ATTN을 동시처리 또는 후처리 시 KA에 의해 유발된 신경세포사멸에 미치는 신경보호 효과를 규명하고자 실험을 실시하였다. KA에 의한 세포사멸을 관찰하기 위해 PI 발색 정도를 기록하였고, cresyl violet 염색과 TUNEL 염색을 통해 PI 결과와 상응하는 세포 생존을 관찰하였다. 또한 활성 산소종의 생성과 lipid peroxidaion의 표지로서 DCF 형광 신호와 TBARS assay를 사용하였다. KA 5 μM을 15시간 동안 처리한 후 CA3 영역에서 후속적인 신경세포 사멸을 관찰하였으며, 또한 활성 산소종과 lipid peroxidation이 증가하였다. 100 μM의 ATPH와 ATTN을 동시 처리하였을 때와 후처리하였을 때, 모두에서 유의미하게 CA3 영역에서의 세포 생존이 증가되었고, DCF의 형광 신호와 lipid peroxidation 정도가 감소되었다. 이상의 결과들을 바탕으로 ATPH와 ATTN이 OHSC에서 KA에 의해 유도된 세포사멸에 대해 보호 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다. ATPH와 ATTN의 동시처리와 후처리 간에 유의미한 차이는 없었지만, ATTN이 ATPH 보다 나은 보호 효과를 가지는 경향성을 나타내었다.

[영문]Kainic acid (KA), an agonist for kainate and AMPA receptors, is an excitatory neurotoxic substance. It activates ionotropic receptors of glutamate and results in transmembrane ion imbalance, especially causing calcium influx, which in turn generates reactive oxygen species (ROS). ROS attack macromolecules within neurons, resulting in membrane lipid peroxidation, structural and functional changes in proteins and DNA strand breaks. Vitamin E such as alpha-tocopherol (ATPH) and alpha-tocotrienol (ATTN) is a chain-breaking antioxidant, preventing the chain propagation step during lipid peroxidation. In the present study, the neuroprotective effects of ATPH and ATTN on KA-induced neuronal death using organotypic hippocampal slice culture (OHSC) have been investigated. For detection of neuronal cell death by KA, cellular uptake of the fluorescent dye propidium iodide (PI) was recorded. Cresyl violet and TUNEL staining were performed to indicate cell survival and apoptotic cell death in correspoding to the results of PI uptake. Dichlorofluorescein (DCF) fluorescence and thiobarbiturate reactive substances (TBARS) were used as markers of ROS formation and lipid peroxidation, respectively. After 15 h KA (5 μM) treatment, delayed neuronal death was detected in CA3 region and ROS formation and lipid peroxidation were also increased. Both co-treatment and post-treatment of ATPH (100 μM) or ATTN (100 μM) significantly increased cell survival and reduced the number of TUNEL-positive cells in CA3 region. Increased DCF fluorescence and levels of TBARS were decreased by ATPH and ATTN. These data suggest that ATPH and ATTN treatment have protective effects on KA-induced cell death in OHSC. ATTN treatment tended to be more effective than ATPH, even though there was no significant difference between ATPH and ATTN in co-treatment or post-treatment.