전구지방세포에서 퓨린성 수용체에 의한 세포 내 칼슘이온 조절

Abstract

[한글]세포 외에서 ATP가 원형질막 G-단백의 일종인 P2Y 수용체에 결합하게 되면 다양한 생리학적 작용을 하게 된다. 단기간으로는 세포 외 뉴클레오티드로써 작용을 하며, 장기간으로는 세포의 증식, 분화, 세포사멸에 관여하기도 한다. 전구지방세포인 3T3-L1 세포는 마우스 태아로부터 분리하였으며, 일반적으로 in vitro 상에서는 지방세포로 분화하거나 지방세포의 기능을 하기도 한다. 그러나 아직까지 전구지방세포에서 P2Y 수용체 아형의 종류나 역할에 대해서 알려지지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 칼슘 이미징 기법과 역전사 연쇄 중합반응의 방법을 이용하여 3T3-L1 세포에 발현된 P2Y 퓨린성 수용체의 아형과 기능적 특성을 규명해 보고자 하였다. 본 연구를 통해 규명된 주요 결과는 다음과 같다. 1. ATP (EC50=224±0.06 μM, N=5, n=35)에 의한 [Ca2+]i은 농도 의존적으로 증가하였으며, 세포 외에 칼슘이 제거된 조건에서도 ATP에 의해서 [Ca2+]i이 증가하였다. 2. P2Y 수용체의 비선택적인 길항제인 suramin (1 mM) 투여 시에는 ATP에 의한 [Ca2+]i이 대조군과 비교하여 대부분 억제되었다. 3. U-73122 (1 μM)은 ATP에 의한 [Ca2+]i 증가를 대부분 (n=34) 억제하였으나, U-73343 (1 μM) 투여 시에는[Ca2+]i이 억제되지 않는 것으로 나타났다. 4. 전구지방세포와 분화된 지방세포에서 발현되는 특정 유전자 (G0/G1) 간에는 확연한 차이가 있음을 볼 수 있다. 5. 실시간 역전사 연쇄 중합반응을 이용하여 P2Y2, 5, 6 아형의 수용체가 발현되어있고, 특히 P2Y5가 가장 많이 발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 전구지방세포에서는 IP3R3가 가장 많이 발현되어 있었지만, 지방세포로 분화된 후에는 IP3R3 발현이 거의 없음을 확인하였다. 6. 퓨린성 수용체에 의해 시간의존적으로 cAMP의 농도가 증가하였다. 이상의 결과들로부터 전구지방세포에서는 P2Y5 수용체가 가장 많이 발현되어 있으며, 복합적인 P2Y 수용체 (P2Y2, 5, 6)는 세포 내 칼슘이온농도와 cAMP를 조절하여 세포의 증식과 분화에 관여할 것으로 사료된다.

[영문]Extracellular ATP elicits diverse physiological effects by binding to the G-protein-coupled P2Y receptors on the plasma membrane. In addition to the short-term effects of extracellular nucleotides on cell functions, there is evidence that such purinergic signalling can have long-term effects on cell proliferation, differentiation and death. The 3T3-L1 cell line derived from mouse embryo is a well-established and commonly utilized in vitro model for adipocytes differentiation and function. However, the distributions and roles of P2Y subtypes are still unknown in the preadipocyte. In this study we identified the distributions and roles of P2Y subtypes in preadipocyte using Ca2+ imaging and realtime-PCR.

ATP (EC50=224±0.06 μM, n=9) increased the [Ca2+]i in a concentration-dependent manner. ATP increased Ca2+ in absence and/or presence of extracellular Ca2+. Suramin, non-selective P2Y blocker, largely blocked the ATP-induced Ca2+ response. U73122, a PLC inhibitor, completely inhibited Ca2+ mobilization in 3T3-L1 cells. The mRNA expression by realtime-PCR of P2Y subtypes was P2Y2:P2Y5:P2Y6=3.13:38.97:1. Functional P2Y receptor, particular in P2Y5 mediates an increase in intracellular cAMP at high concentration of ATP in 3T3-L1 cells. The relative expression of P2Y subtypes was markedly changed particular in differentiated adipocytes attaining a newly G0/G1 gene.

In conclusion, we showed that P2Y5 receptor is a dominant purinergic receptor in preadipocytes, and multiple P2Y receptors could involve in differentiation and migration via regulating of intracellular Ca2+ and cAMP level.