캐스파제 억제제 LB84451의 알코올성 간손상 및 간성상세포에 미치는 효과

Abstract

[한글]간손상은 간세포의 사멸과 간성상세포의 활성화에 의한 간섬유화가 특징이다. 간세포의 사멸은 간손상을 증가시키고, 간성상세포를 활성화시켜 교원질을 생성하여 간섬유화를 유발하는 반면에 간성상세포의 사멸은 간섬유화를 감소시킨다. 간조직에서의 세포사멸 억제는 간손상을 약화시키고, 간세포 사멸을 억제하여 간성상세포의 활성화를 차단시켜 줄지 아니면 활성화된 간성상세포의 사멸을 억제하여 오히려 간섬유화를 증가시킬지 이 두 가지 상반된 작용의 종합적인 결과에 의해 결정될 것으로 예상된다. 세포사멸에 중요한 역할을 하는 캐스파제는 프로테아제의 일종으로 캐스파제를 억제시키면 세포사멸이 억제된다. 아직 간성상세포의 세포사멸과 알코올성 간손상에 대한 캐스파제 억제에 대한 연구가 없다. 따라서 본 연구에서는 간성상세포에 대한 캐스파제 억제는 인간 간성상세포주에 대하여 새로운 광범위 캐스파제 억제제인 LB84451를 처리하여 효과를 관찰하였고, 백서를 이용한 알코올성 간손상 동물모델에서 LB84451를 처리하여 캐스파제 억제제가 알코올성 간손상과 간섬유화에 어떤 실제적인 효과가 나타나는 지를 관찰하였다. 간성상세포주의 세포사멸은 tryphan blue 염색과 MTT 분석을 이용하였다. 간세포의 사멸은 terminal deoxynucleotdyl transferase dUTP nick-end labeling assay로 정량 분석하였고, 캐스파제-3과 캐스파제-8의 활성도는 EnzChek Caspase Assay kit로 분석하였다. 간손상의 정도는 serum aspartate aminotransferase (AST)와 alanine aminotransferase (ALT), 간조직 병리 소견으로 판정하였고, 간조직에서의 교원질 침착은 trichrome 염색과 Sirius red 염색으로 분석하였다. 활성화된 간성상세포와 간섬유화의 정도를 보기 위하여 교원질, alpha-smooth muscle actin (α-SMA)과 transforming growth factor-beta (TGF-β)의 mRNA 발현을 real-time polymerase chain reaction으로 평가하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 인간 간성상세포주에서 gliotoxin으로 유도된 세포사멸에 대하여 캐스파제 억제제 LB84451은 캐스파제-3과 캐스파제-8의 활성을 억제하여 간성상세포의 세포사멸을 억제하였다.

2. Sprague-Dawley 백서에서 6% 에탄올을 함유한 Lieber-Decarli liquid diet를 12주 섭취시키면 혈청 AST와 ALT의 상승, 조직학적으로도 지방성 변화와 세포 사멸체가 증가되어 이 모델은 알코올성 간손상 모델로 유용하였다.

3. 알코올 식이군에서 교원질 m-RNA, α-SMA m-RNA와 TGF-β m-RNA의 발현이 상승하여 간손상에 따른 간성상세포의 활성화가 관찰되었고, 간조직 내에서 캐스파제-3과 캐스파제-8의 활성도가 증가되었다.

4. 알코올 식이와 캐스파제 억제제 LB84451을 투여한 군에서는 알코올 식이군에 비해 AST와 ALT의 상승이 억제되어 감소하였고, 조직학적으로도 지방성 변화가 뚜렷하게 감소되었다.

5. 알코올 식이와 캐스파제 억제제 LB84451을 투여한 군에서 간세포의 사멸이 현저하게 감소하였고, 간조직 내에서 캐스파제-3과 캐스파제-8의 활성도도 유의하게 감소되어 캐스파제 억제로 인하여 세포사멸이 억제되었다.

6. 알코올 식이와 캐스파제 억제제 LB84451을 투여한 군에서 교원질 m-RNA와 α-SMA m-RNA의 발현이 감소되어 간성상세포의 활성화가 억제되었다.

이상의 결과로 캐스파제 억제제 LB84451은 알코올성 간손상을 효과적으로 억제시키며 간 조직 내의 캐스파제 활성을 억제 시켜 세포 사멸을 억제 시켜 간손상을 최소화 시켜 준다. 또한 간성상세포의 사멸 억제에 따른 간섬유화 촉진 보다는 간세포 사멸 억제에 따른 간손상을 억제시켜 간섬유화에 관련된 교원질과 α-SMA의 m-RNA 발현을 억제시키는 것이 확인되어 캐스파제 억제제 LB84451은 알코올성 간손상과 이로 인한 간섬유화 억제의 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 생각한다.

[영문]Hepatic injury is characterized by hepatocyte apoptosis and fibrosis by activated hepatic stellate cells (HSC). Hepatocyte apoptosis promotes hepatic injury and activate HSC to produce collagen, whereas apoptosis of activated HSC attenuate hepatic fibrosis. Inhibition of liver cell apoptosis may attenuate hepatic injury and activation of HSC by blocking apoptosis of hepatocyte or promote fibrosis by allowance of accumulation of activated HSCs. Apoptosis is executed by caspases, a family of intracellular proteases. Pharmacological inhibition of caspase activity attenuate apoptosis. There was no study concerning of caspase inhibition directly on HSCs or alcohol induced hepatic injury. We examined the effect of noble pan-caspase inhibitor LB84451 on the human HSC cell line (hTERT) and alcohol induced hepatic injury model in rat to ascertain the net effect of inhibiting liver cell apoptosis on alcohol induced hepatic injury and hepatic fibrogenesis. HSC apoptosis was assessed by tryphan blue staining and MTT assay. Hepatocyte apoptosis was assessed by the terminal deoxynucleotdyl transferase dUTP nick-end labeling assay. The activity of caspase-3 and caspase-8 was assessed by EnzChek Caspase Assay kit. Hepatic injury was assessed by serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) determination and histopathology. Collagen deposion in liver tissue was quantitated by trichrome staining and Sirius red staining. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to measure mRNA for collagen, alpha-smooth muscle actin (α-SMA) and transforming growth factor-beta (TGF-β) for markers of HSC activation and fibrogenesis. Increased caspase-3 and caspase-8 activity in gliotoxin treated HSCs were attenuated by a novel caspase inhibitor LB84451. Gliotoxin induced HSC apoptosis was reduced by LB84451. Alcoholic hepatic injury, fatty liver change, hepatocyte apoptosis and hepatic fibrosis were induced in the alcohol induced hepatic injury rat model. Increased caspase-3 and caspase-8 activity of the liver in the alcohol injury were attenuated by LB84451. Liver apoptosis by alcohol induced hepatic injury was reduced by LB84451. LB84451 reduced HSC activation which was represented by α-SMA and collagen mRNA production.

In conclusion, the noble caspase inhibitor LB84451 attenuated apoptosis of both hepatocyte and HSCs. The net effect of LB84451 on the alcoholic induced hepatic injury was attenuation of hepatic injury and fibrogenesis. This reduction of hepatic fibrogenesis by LB84451 is assumed mainly through reducing apoptosis of hepatocyte. Collectively, these data suggest that the noble pan-caspase inhibitor LB84451 is a promising agent for alcoholic liver injury and fibrosis.