망막색소상피세포에서 protease-activated receptor(PAR)의 역할

Abstract

[한글]Protease-activated receptor(PAR)는 초기에 thrombin 수용체로 알려졌으며 G-단백 결합 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)로서 독특한 활성 메커니즘을 가지는데 세포외의 protease에 의해서 N-말단 부분이 잘리게 되면 같은 수용체의 세포외 2번째 고리에 붙어서 신호전달이 활성화 된다. 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cell, RPE cell)는 혈액으로부터 포도당, 레티놀, 지방산과 같은 영양분을 광수용체로 운반해주며, 다양한 성장인자를 분비하여 맥락막모세혈관내피 및 광수용체의 형태적 안정화에 관여한다. PAR는 지혈 및 세포 이동(migration), 염증반응 및 통증에 관여하고 암세포의 성장과 전이에도 밀접히 관련되어 있다고 보고되었다. 그러나 망막색소상피세포에서 PAR의 발현양상이나 그 조절에 관한 연구는 아직 미흡하다. 따라서 본 연구에서는 첫 번째로 망막색소상피세포에서 PAR의 발현 특성을 살펴보고, 두 번째로 PAR의 망막색소상피세포에서의 신호전달 과정을 알아보고자 하였다. 마지막으로 PAR의 활성과 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)과의 관계를 알아보고자 하였다. 이를 위하여 형광 염료를 이용한 세포 내 Ca2+ 측정, 실시간 역전사 연쇄중합반응, flexstation 분석법과 같은 실험 방법을 이용하였으며, 본 연구의 주요 실험결과는 다음과 같다.

비선택적 PAR 효현제인 thrombin, trypsin에 의해 농도 의존적으로 세포 내 Ca2+ 농도가 증가하였다(EC50=3.4±0.08 nM, EC50=25.4±0.13 nM). 또한 선택적 PAR 효현제인 TFLLR-NH2(PAR-1)과 SLIGRL-NH2(PAR-2)에 의해서도 세포 내 Ca2+ 농도가 증가하였으며 이러한 증가는 세포 외액의 Ca2+과는 무관하게 내부에서 조절됨을 알 수 있었다. PAR 효현제 처리 시 증가된 Ca2+은 PLC 억제제인 U73122 (2 μM)의 전처치에 의해서 대부분 억제되는 것을 확인하였고, 비활성 형태의 유사체인 U73343 (2 μM)을 3분간 전처치 하였을 때는 변화가 나타나지 않았다. 또한 IP3(inositol 1,4,5-trisphosphate) 수용체 봉쇄제인 2-APB (50 μM)의 전처치에 의해서 PAR 효현제에 의한 세포 내 Ca2+ 증가가 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 망막색소상피세포에서 IP3 수용체 아형 1~3이 모두 발현되어 있는 것을 확인하였다. 망막색소상피세포에는 PAR의 아형 1~4가 모두 발현되어 있으며 PAR-1, 3이 주로 많이 발현되어 있는 것을 실시간 역전사 연쇄중합반응으로 확인하였다. 망막색소상피세포를 PAR 효현제로 24시간 처리 시 염증성 사이토카인인 TNFa(tumor necrosis factor-a)와 IL-6(interleukin-6)의 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다.

이상의 결과들로부터 망막색소상피세포에서 PAR 활성에 따른 세포 내 Ca2+ 조절은 PLC-IP3를 통해 이루어지고, PAR 활성화와 염증성 사이토카인의 증가가 연관되어 있음을 알 수 있었다. 이는 망막색소상피에서 염증반응의 조절기전을 연구하는데 중요한 기초 자료가 될 것으로 생각한다.

[영문]Protease-activated receptors (PARs) are G-protein coupled receptors respond to extracellular protease. The retinal pigment epithelium (RPE) cell is a monolayer of cells lying between the retinal photoreceptors and the choroidal blood supply. RPE cells respond to oxidative stress, inflammation, and retinal degeneration. Until now, the expression profile of PARs is still unknown. In this study we identified the role of PARs in RPE cells, such as HRPE and ARPE cell, using fluorescence Ca2+ imaging technique and real-time PCR.

Thrombin and trypsin, PAR receptor agonists, increase the [Ca2+]i in a concentration-dependent manner (EC50=3.4±0.08 nM, EC50=25.4±0.13 nM, respectively). Selective peptide agonist of PAR-1 (TFLLR-NH2) and PAR-2 (SLIGRL-NH2) increase the [Ca2+]i. PAR agonists increase the [Ca2+]i independent of extracellular Ca2+ levels. Furthermore, U73122 (2 μM), a PLC inhibitor, completely blocked the Ca2+ increment by activation of PAR receptors. The IP3R(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors) 1~3 are expressed in RPE cells. All subtype of PAR receptors are identified and PAR-1, PAR-3 dominantly expressed. PAR receptor agonists exposure significantly increased mRNA expression of the pro-inflammatory cytokine TNFa(tumor necrosis factor-a), IL-6(interleukin-6). Taken together, we suggest that PAR receptors in RPE cells may contribute to the pathogenesis of inflammatory disease of the RPE cells.