신생아 저산소성-허혈성 뇌 손상 동물 모델에서 아데노바이러스 벡터를 이용하여 BDNF(brain derived neurotrophic factor)를 발현하는 인간 신경줄기세포의 이식

Abstract

[한글]신생아 저산소성-허혈성 뇌 손상 (neonatal hypoxic-ischemic brain injury)은 주산기 가사 (perinatal asphyxia)에 의해서 신생아에서 발병하는 대표적 중증 신경계질환으로 만삭아 1000명 출생아 중 2명에서 발병하고, 미숙아의 경우 약 60%까지 발생한다고 보고되며, 이들 중 상당수에서 신경발달 장애소견을 보인다. 허혈성 뇌 손상은 일반적으로 대뇌피질(cerebral cortex), 해마(hippocampus)등의 부위에서 현저하나 신생아에서는 간뇌 (diencephalon), caudate nucleus, putamen, globus pallidus 등의 기저핵 (basal ganglia) 부위에도 신경세포의 손상이 두드러져 영구적 신경기능상실을 초래한다. 현재까지의 연구에 의하면 손상된 중추신경계의 재생은 거의 불가능하거나 극히 제한적이기 때문에 대부분의 치료는 합병증을 예방하거나 비정상적인 운동 패턴과 경직을 감소시키는데 더욱 중점을 두어 왔다. 또한 척수손상, 뇌졸중 및 파킨슨병 등에서 신경치료는 각종 동물 모델을 통한 연구가 활발히 진행 중이나, 저산소성-허혈성 뇌손상 모델에 대한 연구는 그다지 많지 않은 편이다. 최근 들어 저산소성-허혈성 뇌손상에 대한 많은 연구가 이뤄지고 있고 임상적인 치료를 통해 생존율이 증가한 것은 사실이지만 생존한 경우에도 신경학적 장애를 보이고 있기 때문에 보다 근본적인 치료방법이 절실하다.

신경줄기세포란 미성숙, 미분화된 상태로 계속 증식하는 자가 갱신 (self-renew)을 보이고, 신경원세포 (neuron) 및 신경교세포 (glia)로 분화하는 분화의 다능성(multipotency)을 보이는 세포로 정의된다. 신경줄기세포의 증식, 성장 및 분화에 대한 기초연구와 줄기세포의 가소성 (plasticity)을 이용하여 한번 손상되면 특별한 치료 방법이 없는 난치성 신경계질환에 대한 세포 및 유전자치료를 시도할 수 있어 신경계에 대한 재생 의학적 접근 가능성을 제시한다고 하겠다. 뇌손상 후 신경 화학적 변화는 세포사 반응뿐만 아니라 내인성으로 신경보호 반응도 함께 일어나 신경보호 효과를 나타낸다. 이런 경우 중요한 역할을 하는 것이 신경영양인자(neurotrophin)이며 또 회복 과정에서 신경영양인자는 신경가소성을 이끄는 것으로 생각되고 있다. 그 외 신경영양인자는 척추동물의 신경계 발생과정 중 신경세포의 생존과 분화를 결정하는데 절대적으로 필요한 물질이다. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)는 nerve growth factor (NGF)와 더불어 대표적인 신경영양인자로서 감각신경세포와 운동신경세포의 생존에 중요한 역할을 할뿐만 아니라, 척추동물의 발생과정에서 axon과 dendrite의 성장, 새로운 시냅스의 형성 등 신경세포의 여러 활동에 많은 영향을 끼친다. 또한 중추신경계에서 신경세포 생존과 분화뿐만 아니라 시냅스전달(synaptic transmission)과 시냅스 가소성(synapse plasticity)의 분자기전에 필수적인 역할을 담당하고 있다.

본 연구에서는 생후 7일의 CD-1 쥐에서 우측 경동맥을 결찰 하여 영구적인 허혈성 뇌손상을 유발한 후, 8%의 저 산소 통에서 90분 동안 저산소증에 노출하여 저산소성 허혈성 뇌손상을 유발하였다. 그리고 BDNF를 발현하는 adenoviral vector를 제작하여 임신 13주 태아 종뇌 (telencephalon) 부위에서 채취되어 배양된 인간신경줄기세포에 감염시켜 BDNF 발현 인간신경줄기세포를 확립하였다. 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델을 대상으로 생후 14일 경 실험군으로는 인간신경줄기세포와 BDNF 발현 인간신경줄기세포를 각각 뇌손상 부위에 이식하였고, 대조군으로는 H-H buffer를 뇌손상 부위에 주입하였다.

본 연구 결과 BDNF 발현 인간신경줄기세포를 이식한 실험군에서 대조군에 비해 뇌경색증 부위의 크기가 의의 있게 감소함을 확인하였으며 (p<0.05), 행동능력평가에 있어서 rota-rod와 wire maneuver test에서는 실험군과 대조군 간에 유의한 차이가 관찰되지는 않았지만 neurological test에서 인간신경줄기세포 및 BDNF 발현 인간신경줄기세포를 이식한 실험군이 대조군에 비해 neurological score가 감소하는 경향을 확인하였다. 또 Morris water maze test에서는 BDNF 발현 인간신경줄기세포 이식군에서 대조군에 비해 학습과 기억능력이 향상됨을 보였다. 면역조직화학 검사를 통하여 동물모델에 이식된 인간신경줄기세포가 뇌경색증 부위에서 확고히 생착 됨을 관찰하였고, 공여세포는 주로 신경원세포로 분화하였으며 뇌경색증 주위 부위의 대뇌 피질 신경원세포의 신경돌기들의 신장이 발달되었음이 관찰되었다.

결론적으로 신생아 저산소성-허혈성 뇌손상 동물 모델에 인간 신경줄기세포 혹은 BDNF 발현 인간신경줄기세포를 이식할 경우 뇌경색 크기가 감소하였고, 운동행동능력 검사에서는 상지 운동능력과 운동조정기능에서 통계적으로 유효한 차이를 보이지는 않았지만 Neurological test상 신경학적 기능은 향상되었고, Morris water maze test 상 BDNF 발현 인간신경줄기세포를 이식한 군에서 대조군에 비해 통계적으로 의의 있게 학습 및 기억능력의 향상을 확인하였다. 따라서 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상에서 인간신경줄기세포 혹은 신경영양인자 발현 인간신경줄기세포의 이식은 뇌손상 부위를 감소시키고, 손상된 신경세포를 대체 및 재생시켰으며, 신경기능 및 인지기능의 향상을 유발하는 세포 및 유전자치료법을 제공하여, 향후 뇌성마비 등의 중증 난치성 신경계질환에서 신경재생치료 가능성을 제시하였다.

[영문]Neonatal hypoxic-ischemic (HI) brain injury is the disruption of blood and oxygen delivery to the brain of a newborn infant. It represents a major cause of neurological injury in newborn infants. Neonatal HI brain injury occurs in 1-2 of 1,000 live term births, and -60% of the preterm infants who are afflicted with this type of injury sustain permanent brain damage. HI damage usually occurs in the cerebral cortex and hippocampus, but during the perinatal period, it occurs in the diencephalon, caudate nucleus, putamen, globus pallidus, and basal ganglia. This leads to long-lasting devastating disorders.

According to a number of recent researches on this subject, the central nervous system (CNS) cannot be regenerated. Therefore, most of the therapeutic approaches to CNS injury focus on neuroprotection and the reduction of neuronal damage. While many studies have endeavored to develop novel therapeutic modalities using animal models of Parkinson’s disease, stroke, and spinal-cord injury, relatively few studies have been conducted using a neonatal HI brain injury model despite the fact that HI brain injury in newborn infants results in serious permanent developmental and neurological handicaps as well as socioeconomic problems. Therefore, the development of new fundamental therapeutic tools for reducing neuronal injury and for neuroregeneration is urgently needed.

Neural stem cells (NSCs) are immature and undifferentiated and are characterized by the ability to renew themselves through mitotic cell division. They also show multipotency-differentiating, specialized cell types, such as neuron and glia. When NSCs were implanted into a diseased or injured nervous system, they showed not only preferential extensive migration to and engraftment within areas with discrete as well as diffuse abnormalities, but also the capability to replace diseased tissue in an appropriate manner. Therefore, NSCs could be harnessed to develop cell- and stem-cell-based gene therapy for intractable neurological disorders.

After sustaining brain injury, there are responses to neuronal apoptosis and a more potent capacity for endogenous regeneration and neuroprotection because of the neurotrophins. Neurotrophins are a family of proteins that induce the survival, development, and function of the neurons. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is known not only to play a role in inducing neurogenesis and neural development but also as being essential for synaptic transmission and plasticity.

In this study, to investigate the therapeutic potentials of human neural stem cells (hNSCs) in a neonatal HI brain injury model, postnatal-day-7 (P7) CD-1 mice were subjected to unilateral right-common-carotid-artery ligation to induce ischemic brain injury. They were then exposed to 8% oxygen for 90 min, which induced HI brain injury. hNSCs were cultured from the telencephalon of a fetal cadaver at 13 weeks of gestational age and were engineered to express BDNF by adenoviral vector before transplantation. Seven days after the induction of HI brain injury, the hNSCs and BDNF-expressing hNSCs, as well as a vehicle, were injected into the HI-brain-injured lesions, respectively.

As a result, the mice into which BDNF-expressing hNSCs had been transplanted showed a significant reduction of the HI-injured brain volume compared to the vehicle-injected control group. The mice with HI brain injury into which hNSCs and BDNF-expressing hNSCs had been transplanted obtained better neurological scores in the neurological test that was conducted compared to the control group, and the mice into which BDNF-expressing hNSCs had been implanted showed better learning and memory functions compared to the control group in the Morris Water maze test that was administered. There was no significant difference, however, between the cells-injected experimental group and the control group in the rota-rod and wire maneuver test. The mice into which hNSCs and BDNF-expressing hNSCs had been transplanted showed robust engraftment and foreign-gene expression (GFP and BDNF) within their HI-injured brain lesions. The BDNF-expressing hNSCs were mainly differentiated into the neurons in the HI-injured lesions and the adjacent cortical penumbra. In addition, the BDNF that had been secreted from the donor-derived cells appeared to develop neurites extension and arborization in the host cortical neurons in the cortical penumbra.

In conclusion, the results of this study suggest that the transplantation of hNSCs or BDNF-expressing hNSCs into a neonatal HI brain injury model provides novel cell- and stem-cell-based gene therapy, which could induce significant neuroprotection and could significantly improve the neurological and cognitive functions. Therefore, the therapeutic potentials of hNSCs or BDNF-expressing hNSCs transplantation could be exploited for the treatment of HI brain injury in newborn infants.