The role of Foxc2 on osteoblast differentiation

Abstract

[한글]배아발생과 세포분화에 중요한 조절인자로 알려진 Foxc2는 forkhead/ winged helix 전사인자 family중의 하나로, Foxc2 결핍 쥐에서 두개 안면골격 및 척추의 일부 결손이 나타나고 대동맥 형성의 장애를 보여, 골격과 혈관 생성의 정상적인 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 최근에는 Foxc2가 지방세포에 표현되며 Foxc2를 과 발현시킨 쥐에서 고지방식이에 의한 체중증가 및 인슐린 저항성이 감소되었고, 일부 보고에서 Foxc2가 간엽세포에서 지방세포로의 분화를 억제하였다고 하였다. 조골세포와 지방세포가 하나의 간엽세포에서 유래한다는 사실을 고려할 때 Foxc2가 간엽세포에서 조골세포로의 분화에 중요한 역할을 할 것이란 가설을 세웠다.

본 연구에서는 배아발생 13.5일째 두개골을 배양 시키고, 전기천공법을 이용하여 Foxc2가 측두골 사이의 간엽세포에서 과발현 되도록 하였다. Foxc2 과발현 시켰을 때 조골세포로의 초기분화 표지자인 알칼라인 포스파타제에 염색되는 세포들이 대조군에 비해 많이 관찰되었다. 성숙한 조골세포의 표지자인 bone sialoprotein은 Foxc2 과발현 군에서 일부 표현되었으나, 대조군에서는 거의 표현되지 않았다. 전구 조골세포에서 조골세포로의 분화를 유도하는 동안 Foxc2-siRNA를 처리하여 분화정도에 차이가 있는지 조사하였다. 대조군에서는 분화 4일째 알칼라인 포스파타제 염색에서 양성을 보였으나, Foxc2-siRNA군에서는 거의 염색되지 않았다. 또한 무기질화 결절을 의미하는 알리자린레드 염색도 분화 17일째 대조군에 비해서 Foxc2-siRNA군에서 약하게 염색됨을 관찰하였다. 이상의 결과로 Foxc2가 간엽세포에서 조골세포로의 분화 및 전구 조골세포에서 조골세포로의 분화를 촉진시킴을 알 수 있었다.

Foxc2가 조골세포 분화를 촉진시키는 기전을 규명하기 위해서, 조골세포의 분화에 중요한 Wnt-beta-catenin 신호전달과 전사인자 Runx2와의 관계를 C3H10T1/2 세포와 MC3T3-E1 전구 조골세포에서 조사하였다. 두 세포에서 Wnt3a를 처리하였을 때 Foxc2 단백표현이 의미있게 증가하였다. Foxc2 과발현을 시켰을 때 beta-catenin mRNA 표현은 증가하지 않았으나 활성형 beta-catenin 단백이 증가하였다. Foxc2에 의해 증가된 활성화 beta-catenin이 실제 전사인자를 조절하는지 알아보기 위해 TOPflash reporter 플라스미드 (TCF/LEF 결합부위 포함)를 이용하여 luciferase 활성도를 조사하였다. Foxc2 를 과발현 시켰을 때 대조군에 비해 TCF/LEF 활성도를 4배 정도 의미있게 증가시켰다. 또한 protein kinase A (PKA) 억제제를 처리한 후에는 Foxc2에 의해 증가된 TCF/LEF 활성도가 40% 정도 억제됨을 관찰하였다. 또한 Foxc2 과발현이 전구조골세포에서 Runx2 mRNA 및 단백 표현에는 영향을 미치지 않았으나 Runx2 활성도를 2배 정도 증가시켰다.

결론적으로 Foxc2는 간엽세포와 전구조골세포에서 조골세포로의 분화를 촉진하는 작용을 나타냈다. Foxc2가 조골세포 분화를 촉진하는 가능한 기전으로 Foxc2가 cAMP/PKA 신호전달을 증가시켜서 beta-catenin을 활성화시키고, Wnt 신호전달을 활성화시키는 것으로 생각되며, 일부에서 Runx2 활성도를 증가시킴으로써 작용하는 것으로 보인다.

[영문]The forkhead box C2 (Foxc2) protein is a member of the family of winged helix/forkhead transcription factors. Mice deficient in the Foxc2 gene display defective formation of the aortic arches, multiple craniofacial bones, and the vertebral column. However, little is known about how this transcriptional factor functions in the proliferation of cells and osteoblast differentiation. Therefore, we investigated the role of Foxc2 in osteoblast differentiation using the developing cranial suture model and the established mesenchyme and preosteoblast cell line.

Calvaria of E13.5 mice were dissected and cultured in a Trowell-type culture dish. Plasmid DNA containing Foxc2 was transfected into the suture mesenchymal cells by electroporation. Foxc2-siRNA transfection was performed using transfection reagents. Immunohistochemical staining was performed after 48h of culture. Alkaline phosphatase (ALP) was stained strongly in the suture mesenchymal cells in the Foxc2 overexpressed calvaria, whereas the control revealed weak ALP staining in the suture mesenchymal cells. Moreover, we found that bone sialoprotein (BSP), a marker for mature osteoblasts, was weakly expressed in the suture mesenchymal cells in the Foxc2 overexpressed calvaria. There was no BSP staining in the suture mesenchymal cells of the control. These findings suggested that Foxc2 over-expression was able to stimulate osteoblast differentiation of suture mesenchymal cells. In addition, we examined whether Foxc2 plays a role in the differentiation of MC3T3-E1 preosteoblasts. Foxc2-siRNA treated cells showed decreased ALP staining and Alizarin red staining compared to the control cells during induction of osteoblast differentiation in MC3T3-E1 cells.

We examined whether Foxc2 affects the Wnt-beta-catenin signaling pathway to elucidate the molecular mechanism by which Foxc2 stimulates osteoblast differentiation. Foxc2 over-expression increased active beta-catenin levels and stimulated the T cell factor/lymphoid enhancer factor (TCF/LEF) transcriptional activity in MC3T3-E1 preosteoblasts and C3H10T1/2 cells. Moreover, Wnt3a (50ng/mL) increased Foxc2 protein levels in MC3T3-E1 and C3H10T1/2 cells. A protein kinase A (PKA) inhibitor, H-89, suppressed Foxc2-mediated increase of TCF/LEF transcriptional activity in the C3H10T1/2 cells (40%, P < 0.01). In addition, Foxc2 enhanced Runx2 transcriptional activity without any change of the Runx2 expression in the preosteoblast cells.

In conclusion, our results demonstrated that Foxc2 stimulated osteoblast differentiation of mesenchymal cells and preosteoblasts. The activation of canonical Wnt-beta-catenin signals might be involved in the Foxc2-mediated stimulation of osteoblast differentiation. At least, activation of Runx2 plays a role in the stimulation of differentiation by Foxc2 in the preosteoblasts.