Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into neural lineage by modulation of BMP and Activin/Nodal signaling pathways

Abstract

[한글]인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)를 비롯해 최근 체세포 리프로그래밍(reprogramming)을 통해 개발된 유도 전분화능줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPS cells)를 난치성 질환 치료에 적용하기 위해서는 특정 세포로의 분화기술 개발이 필수적이다. 최근 한 연구에 따르면 인간 배아줄기세포는 세포주마다 각각이 선호하는 분화 경향성 (differentiation propensity)을 가지고 있어 자발적 분화 조건에서 특정 계열의 세포로만 분화하려 하며, 이런 경향성은 기존의 특정세포로의 분화법(directed differentiation method)에 의해서도 잘 극복되지 않는다고 보고되었다. 본 연구에서도 4개의 서로 다른 연구기관에서 수립된 6종의 인간 배아줄기세포주와 3종의 인간 유도 전분화능줄기세포의 분화 경향성을 조사해 본 결과 이들 세포주들 역시 특정 세포로의 분화 경향성을 보이는 것이 확인되었다. 세포주가 가진 분화 경향성은 이들 세포를 원하는 세포로 분화시키려고 할 때 큰 장애가 될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 세포주 각각이 가진 분화 경향성을 극복하고 대부분의 세포주에 공통적으로 적용시킬 수 있는 효율적인 신경분화법(universial protocol for neural differentiation)을 개발하고자 하였다. 특히, 본 연구에서는 세포막 투과성이 우수한 저분자 물질을 통하여 인간 초기신경발생 과정 중 필수적이라고 알려져 있는 여러 신호의 조절을 통해 신경분화법을 개발하고자 하였다. BMP 신호의 억제가 신경발생에 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 따라서 우선 인간 배아줄기세포(H9 cell line)의 배아체(embryoid bodies, EBs)를 통한 분화과정 중에 BMP 신호 특이적인 저해제(dorsomorphin, DM)의 지속적인 처리가 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 그 결과 이 저해제에 의해 신경외배엽 마커들(Sox1, Pax6 and Nestin)의 유의미한 증가가 관찰되었지만 분화된 세포들에서 내배엽성 마커(AFP)와 미분화 마커(Oct3/4)들의 발현은 감소되었지만 여전히 관찰되었다. 따라서 중, 내배엽의 분화와 전분화능의 유지에 중요한 역할을 한다는 것이 알려진 Activin/Nodal pathway의 특이적 저해제(SB431542)를 배아체 분화 과정 중에 처리하였다. 그 결과 중배엽(Brachyury and Cerberus), 내배엽성(AFP and GATA4) 그리고 미분화 마커들(Oct3/4 and Nanog)의 발현이 유의하게 감소되나, 신경 외배엽 마커들의 발현은 크게 변화 없었다. DM alc SB431542에 의해 두 신호가 동시에 억제되었을 때 비로소 신경외배엽으로의 특이적 그리고 효율적 분화가 유도되었고, 다른 계열로의 분화가 최소화됨이 관찰되었다. H9 세포주에서 얻은 BMP 및 Activin/Nodal 신호의 동시 억제에 의한 분화 유도법을 각기 다른 분화 경향성을 보이는 6개 인간 배아줄기세포주와 3개의 유도 전분화능줄기세포주에 적용해 본 결과 모든 세포주에서 공통적으로 매우 효과적인 신경외배엽으로의 분화가 유도되었고, 동시에 다른 계열로의 분화는 억제됨이 관찰되었다. 또한 이와 같은 방법으로 유도된 신경 전구세포는 도파민 신경세포의 분화 유도를 위한 여러 신호전달물질에 반응하여 효과적으로 도파민 신경세포로 분화할 수 있었다. 본 연구를 통해 서로 다른 분화 경향성을 가진 인간 배아줄기세포 및 유도 전분화능줄기세포에 공통적으로 적용할 수 있는 효율적인 신경분화법이 개발되었다. 이 연구는 인간 전분화능줄기세포를 이용한 난치성 뇌신경계질환의 세포치료 관련 연구의 발전에 크게 기여하리라 여겨진다.

[영문]For therapeutic applications, efficient differentiation of human pluripotent stem cells [i.e. human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem (iPS) cells] into the specific cell type or cell lineage of interest is a prerequisite. Recent report demonstrated that each hESC line is skewed towards a certain differentiated lineage. We could also detect marked differences in differentiation propensity among 6 hESC lines generated by 4 institutions as well as 3 human iPS cell lines derived from 3 different types of somatic cells.

Since this innate propensity can often negatively affect differentiation into another cell lineage, all the hESCs as well as iPS cells need to be examined for their differentiation propensity and then appropriate cell lines can be selected for each therapeutic application. This might be troublesome because thorough examinations of differentiation propensity of ever-increasing hESCs and iPS cell lines are laborious, time-consuming, and costly. Therefore, it would be of great benefit if there were a way to induce differentiation of all human pluripotent stem cells into a specific cell lineage of interest, irrespective of their original differentiation propensity. As a proof-of-principle experiment, we set out to establish a universal protocol that drives all the human pluripotent stem cell lines with various differentiation propensities toward the neural lineage. Our strategy to generate such a broadly applicable protocol for neural differentiation was by manipulating signaling pathways critically implicated in embryonic neural induction.

Since inhibition of the BMP signaling has been known to play a role in neural induction, BMP signal was suppressed by a specific inhibitor, dorsomorphin (DM) during spontaneous differentiation as embryoid bodies (EBs) in H9 hESC line. Treatment of 5μM DM during EB differentiation significantly increased neuroectodermal differentiation of hESCs, however it was not sufficient to reduce differentiation into meso/endodermal lineage and remnants of undifferentiated cells. Since Activin/Nodal signal is implicated in meso/endodermal differentiation and maintenance of pluripotency, the specific inhibitor of Activin/Nodal pathway, 10μM of SB431542 (SB) was added into the EB culture to reduce non-neural derivatives in differentiating cells. Although the expression of meso- (Brachyury and Cerberus), endodermal (AFP and GATA4) and undifferentiation markers (Oct3/4 and Nanog) was dramatically reduced by treatment of SB, the neuroectodermal marker (Sox1, Pax6 and nestin) expression was not enhanced. We found that H9 hESCs could exclusively and efficiently differentiate into neuroectodermal lineage, if only BMP and Activin/Nodal signals were simultaneously blocked by combination of DM and SB during EB differentiation. The simultaneous modulation of BMP and Activin/Nodal signaling pathways with the small molecules could also efficiently overcome markedly different differentiation inclination from all 6 hES and 3 iPS cell lines tested. In addition, neural cells generated by the modulation of BMP and Activin/Nodal signaling also could efficiently generate dopaminergic neurons by a simple and commonly used dopaminergic differentiation protocol. In summary, human pluripotent stem cells with a variety of differentiation propensity can be efficiently differentiated into neural lineage by modulation of BMP and Activin/Nodal pathways. This study is very important from a clinical point of view since it would provide not only an efficient method to produce neural cells for treating neurological diseases but also a broadly applicable strategy to generate any type of desirable cells irrespective of innate differentiation potential of human ES and iPS cells.