Colchicine attenuates inflammatory cells infiltration and extracellular matrix accumulation in diabetic nephropathy

Abstract

[한글]

배 경: 당뇨병성 신병증은 투석이나 이식이 필요한 말기 신부전증의 가장 많은 원인 질환이다. 당뇨병성 신병증은 병리학적으로 사구체 및 세뇨관의 비후, 사구체 기저막의 비후, 그리고 세포 외 기질의 축적 등이 특징적인 소견으로 각종 성장 인자들의 활성화, 세포 외 기질 단백의 생성 증가, 세포 외 기질 단백 분해 효소의 감소 등이 당뇨병성 신병증의 발생 및 진행에 관여하는 것으로 보고되고 있으나 명확한 분자생물학적 기전은 아직 잘 알려져 있지 않은 실정이다. 최근에는 당뇨병성 신병증 환자의 신장 조직 내에 염증 세포들의 침윤 소견이 있는 것으로 미루어 보아 염증 반응도 당뇨병성 신병증의 병태생리와 밀접하게 연관되어 있을 것으로 생각되어 지고 있다. 콜히친은 급성 통풍이나 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환 환자에서 흔히 사용되는 약제이지만 염증 세포의 침윤이 특징적인 만성 신우신염, 실험적 사구체신염, 그리고 싸이클로스포린 신독성 모델에서도 항염증 기전을 통하여 신장 섬유화를 억제시켰다는 보고들이 있다. 그러나 염증 반응이 일부 관찰되는 당뇨병성 신병증에서 콜히친의 항염증 및 항섬유화 효과에 대한 연구 보고는 전무한 실정이다. 이에 본 연구자는 streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 백서와 배양 신장 세뇨관 상피세포에서 콜히친의 투여가 염증 반응 및 세포 외 기질의 축적에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

방 법: 생체 내 실험으로는 Sprague-Dawley 백서 32마리를 대조군 (8마리), 당뇨군 (8마리), 그리고 콜히친 (30 μg/kg/day, 구강 투여) 투여 대조군 (8마리) 및 당뇨군 (8마리)으로 나누어 사육한 뒤, 당뇨 유발 12주 후에 신장 피질 조직을 분리하였다. 또한 생체 외 실험으로는 백서 신장 세뇨관 상피세포 (NRK-52E cell)를 정상 포도당군 (5.6 mM), 정상 포도당+만니톨군 (24.4 mM), 정상 포도당+콜히친 (10-8 M) 처치군, 고포도당군 (30 mM), 그리고 고포도당+콜히친 (10-8 M) 처치군으로 나누어 24시간 배양하였다. 신장 조직 및 배양액 내 monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였으며, 신장 조직 및 배양세포 내 MCP-1 mRNA 발현은 real-time PCR을 이용하여 분석하였다. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) 과 fibronectin의 mRNA와 단백 발현도 각각 real-time PCR과 Western blot으로 확인하였다. 또한, 신장 조직 내 ICAM-1과 fibronectin의 단백 발현, 그리고 신장 내 침윤 대식세포는 면역조직화학염색법으로 관찰하였다.

결 과:

1. 24시간 뇨알부민 배설은 대조군에 비하여 당뇨군에서 유의하게 높았으며 (p<0.05), 콜히친 투여 당뇨군에서는 당뇨군에 비하여 뇨알부민 배설 증가가 의미있게 억제되었다 (p<0.05).

2. 신장 피질 조직 및 세뇨관 상피세포에서 MCP-1의 mRNA 발현은 당뇨군과 고포도당군에서 각각 대조군과 정상 포도당군에 비하여 의의있게 증가되었으며 (p<0.05), 콜히친 투여로 MCP-1 mRNA의 증가가 유의하게 억제되었다 (p<0.05). 신장 피질 조직 및 배양액 내 MCP-1 단백 농도도 MCP-1 mRNA 발현 변화와 유사하였다.

3. ICAM-1 mRNA와 단백 발현도 당뇨 신장 조직과 고포도당으로 자극한 상피세포에서 각각 대조군과 정상 포도당군에 비하여 의미있게 증가되었으며 (p<0.05), 콜히친 처치로 이러한 ICAM-1의 발현 증가가 의의있게 감소되었다 (p<0.05).

4. 신장 조직 내 fibronectin mRNA와 단백의 발현은 당뇨군에서 유의하게 증가되었으며 (p<0.01), 이러한 당뇨 신장 내 fibronectin의 발현 증가는 콜히친에 의하여 의미있게 경감되었다 (p<0.05).

5. 면역조직화학염색상 신장 세뇨관-간질 부위의 ICAM-1과 fibronectin 단백의 발현은 당뇨군에서 의의있게 증가되었으며 (p<0.05), 콜히친 투여로 당뇨군에서의 발현 증가가 유의하게 억제되었다 (p<0.05).

6. ED-1 항체를 이용한 면역조직화학염색으로 확인한 침윤 대식세포의 수는 당뇨군에서 대조군에 비하여 의미있게 많았으며 (p<0.01), 당뇨군에서의 대식세포의 침윤은 콜히친에 의하여 의의있게 감소되었다 (p<0.01).

7. Fibronectin의 mRNA 발현과 대식세포의 침윤 사이에는 통계학적으로 유의한 양의 상관관계가 있었다.

결 론: 이상의 결과로, 백서 당뇨병성 신병증에서 콜히친이 MCP-1과 ICAM-1 발현 증가를 의미있게 억제시킴으로써 대식세포의 침윤이 감소되었을 것으로 생각된다. 또한 세뇨관 상피세포에 대한 직접적인 효과뿐만 아니라 이러한 항염증 기전을 통하여 세포 외 기질의 축적이 경감되었을 것으로 사료된다. 따라서, 항염증 및 항섬유화 효과가 있는 콜히친이 당뇨병성 신병증의 발생 및 진행 억제에 유용할 것으로 생각된다.

[영문]

Background: The molecular and cellular mechanisms responsible for diabetic nephropathy (DN) remain incompletely resolved. Even though the diabetic milieu per se, hemodynamic changes, and local growth factors such as angiotensin II are considered to be mediators in the pathogenesis of DN, recent studies suggest that an inflammatory mechanism may also contribute to the pathogenesis of DN. Colchicine, a drug used for acute gouty pain, has been reported to prevent renal fibrosis in various renal disease, including chronic pyelonephritis, experimental glomerulonephritis, and cyclosporine nephrotoxicity via anti-inflammatory mechanism, but the effect of colchicines on DN has never been explored. This study was undertaken to elucidate the effect of colchicine on inflammation and extracellular matrix accumulation in experimental diabetic nephropathy.

Methods: In vivo, thirty-two Sprague-Dawley rats were injected with diluent (C, n=16) or streptozotocin (STZ) intraperitoneally (DM, n=16). Eight rats from each group were treated with colchicine (30 μg/kg/day) by gavage for 3 months (C+Col, DM+Col). In vitro, NRK-52E cells, immortalized rat tubular epithelial cells, were cultured in media with 5.6 mM glucose (NG), NG+24.4mM mannitol (NG+M), NG+10-8 M colchicine (NG+Col), 30 mM glucose (HG), or HG+10-8 M colchicine (HG+Col) for 24 hours. Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) mRNA expression was determined by real-time PCR and the levels of MCP-1 in renal tissue and culture media by ELISA. Real-time PCR and Western blot were also performed for intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and fibronectin mRNA and protein expression, respectively, with renal cortical tissue and cell lysates, and immunohistochemical staining for ICAM-1 and fibronectin with renal tissue. In addition, inflammatory cells infiltration was assessed by immunohistochemical staining using anti-ED-1 antibody.

Results: Twenty-four-hour urinary albumin excretion at 3-months was significantly higher in DM compared to C rats (p<0.05), and colchicine treatment significantly reduced albuminuria in DM rats (p<0.05). MCP-1 mRNA expression and protein levels in renal tissue were significantly higher in DM compared to C rats (p<0.05), and these increases were significantly ameliorated by the administration of colchicine (p<0.05). Similarly, MCP-1 mRNA expression and protein levels in HG-stimulated NRK-52 cells were significantly higher than NG cells (p<0.05), and these HG-induced increases in MCP-1 expression were significantly attenuated by colchicine treatment (p<0.05). ICAM-1 mRNA and protein expression were significantly higher in DM and HG-stimulated tubular epithelial cells compared to C rats and NG cells (p<0.05), respectively, and these changes were significantly abrogated by colchicine treatment (p<0.05). Renal fibronectin mRNA and protein expression were significantly increased in DM rats (p<0.01), and colchicine treatment significantly inhibited these increases in fibronectin expression (p<0.05). Immunohistochemical staining revealed that the number of ED-1 (+) cells were significantly higher in DM compared to C rats (p<0.01), and this increase was significantly attenuated by the administration of colchicine (p<0.01). There was a significant positive correlation between fibronectin mRNA expression and the number of infiltrated ED-1 (+) cells in renal tubulointerstitium.

Conclusion: Colchicine ameliorates the increases in MCP-1 and ICAM-1 expression in experimental diabetic nephropathy, which consequently inhibits inflammatory cells infiltration, and tubular epithelial cells cultured under high glucose conditions. In addition, enhanced fibronectin expression under diabetic conditions is attenuated by colchicine treatment. These findings provide a new perspective upon the renoprotective effects of colchicine in diabetic nephropathy.