Heme oxygenase-1 expression is increased to protect podocyte apoptosis under diabetic conditions

Abstract

[한글]

서론: 당뇨병성 신병증은 국내외적으로 말기 신부전증의 가장 흔한 원인 질환으로, 초기에는 단백뇨가 대표적인 임상적 특징이다. 최근의 보고들에 의하면 단백뇨의 발생에 사구체 여과 장벽을 구성하는 세포의 하나인 족세포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 당뇨병성 신병증에서 족세포의 수 및 밀도가 감소되어 있으며 이는 사구체 여과장벽의 손상을 일으켜 결국 사구체 경화증을 초래하는 요인이 되는데, 이 과정에 당뇨 조건 하에서 생성이 증가된 ROS가 관여하는 것으로 알려져 있다. Heme oxygenase-1 (HO-1)은 미소체 효소로서 산화성 스트레스에 의한 각종 조직 손상에서 발현이 증가되며, 항산화 효과, 항염증 작용, 그리고 항세포사멸 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 당뇨병성 신병증에서도 HO-1의 발현 증가가 보고된 바는 있으나, 그 기능적 역할에 대한 연구는 전무한 실정이다. 이에 본 연구자는 당뇨병성 신병증에서 HO-1의 발현 증가 여부를 확인하고, 당뇨병성 신병증에서 발현이 증가되는 HO-1의 기능적 의미를 알아보기 위하여 생체 내외의 실험을 통하여 HO-1 발현 억제 전후에 족세포 사멸의 변화를 알아보고자 하였다.

방법: 32마리의 Sprague-Dawley 백서를 대상으로 대조군 (16마리)과 복강 내로 streptozotocin을 투여한 당뇨군 (16마리)으로 나누었으며 각 군에서 8마리에는 HO-1의 억제제인 Zinc protoporphyrin (ZnPP, 50 μmol/kg/day)를 6주간 복강 내로 투여하였다. 또한, 불멸 생쥐 족세포 (immortalized mouse podocytes)를 정상 포도당군 (5.6 mM), 정상 포도당+만니톨군 (24.4 mM 만니톨), 정상 포도당+HO-1 siRNA 처리군, 고포도당군 (30 mM), 그리고 고포도당+HO-1 siRNA 처리군으로 나누어 배양하였다. 실험 동물로부터 분리한 사구체와 배양 족세포에서 HO-1 mRNA와 단백 발현은 각각 real-time PCR과 Western blot을 이용하여 분석하였으며, 신장 조직 내 HO-1의 단백 발현은 면역조직화학 염색을 시행하여 확인하였다. 세포사멸은 Bax, Bcl-2, 그리고 active fragments of caspase-3에 대한 Western blot을 이용하여 분석하였으며, 신장 조직을 이용한 TUNEL 염색과 배양 세포를 이용한 Hoechst 33342 염색으로도 확인하였다.

결과: 24시간 뇨알부민 배설량은 대조군 (0.32±0.04 mg/day)에 비하여 당뇨군 (1.18±0.11 mg/day)에서 의미있게 많았으며 (p<0.05), ZnPP 투여 당뇨군에서의 뇨알부민 배설량이 유의하게 더 증가하였다 (1.59±0.19 mg/day) (p<0.05). 사구체 내 HO-1의 mRNA 발현은 대조군에 비하여 당뇨군에서 5.1배 증가되었으며 (p<0.01), ZnPP 투여로 당뇨군에서 발현 증가가 46.6% 억제되었다 (p<0.05). 사구체 내 HO-1의 단백 발현도 mRNA 발현 양상과 유사하였다. 세포 실험상 고포도당으로 자극한 족세포에서 HO-1의 단백 발현은 정상 포도당군에 비하여 2.3배 증가되었으며 (p<0.05), HO-1 siRNA는 HO-1의 단백 발현을 농도 의존적으로 억제시켰다. 세포사멸의 지표인 Bax/Bcl-2 단백 발현의 비와 active fragments of caspase-3의 단백 발현은 당뇨 사구체와 고포도당으로 자극한 족세포에서 의미있게 높았으며 (p<0.05), ZnPP 투여 및 HO-1 siRNA 처치로 의의있게 더 증가되었다 (p<0.01). 사구체 내 TUNEL-양성 세포 수는 대조군 (0.4±0.1)에 비하여 당뇨군 (1.3±0.2)에서 유의하게 많았으며 (p<0.05), ZnPP 투여 당뇨군 (2.2±0.3)에서 의미있게 더 증가되었다 (p<0.05). WT-1에 대한 면역조직화학 염색을 이용하여 측정한 족세포 수는 대조군 (170.0±4.2)에 비하여 당뇨군 (159.1±3.7)에서 적었으며, ZnPP를 투여한 당뇨군 (142.9±3.2)에서 의의있게 더 감소되었다 (p<0.05). Active fragments of caspase-3와 synaptopodin에 대한 이중 면역형광염색을 시행한 결과, 세포사멸이 동반된 세포가 주로 족세포임을 알 수 있었다. 배양 족세포에서 Hoechst 33342 염색을 이용하여 측정한 세포사멸이 동반된 족세포 수도 정상 포도당군 (3.7±0.1%)에 비하여 고포도당군 (11.1±0.2%)에서 유의하게 많았으며 (p<0.05), HO-1 siRNA 처리군 (17.2±0.2%)에서 의미있게 더 증가되었다 (p<0.05).

결론: 당뇨병성 신병증의 동물 모델과 고포도당으로 자극한 족세포에서 HO-1의 발현은 의의있게 증가되었으며, HO-1의 발현 증가를 억제시킬 경우 족세포의 세포사멸이 유의하게 더 증가되었다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 당뇨 조건 하에서 족세포 내 HO-1의 발현 증가는 세포사멸에 대한 보호 역할을 할 것으로 생각된다.

[영문]

Background: Diabetic nephropathy, the leading cause of end-stage renal disease in many countries, is clinically characterized by proteinuria. Recent studies have shown that podocyte injury plays an important role in the pathogenesis of various proteinuric glomerular diseases, including diabetic nephropathy. The number of podocytes is decreased in diabetic glomeruli and reactive oxygen species-mediated apoptosis is known to be involved in the process of podocyte loss under diabetic conditions. Heme oxygenase-1 (HO-1), a microsomal enzyme, has been regarded as an anti-oxidant and to be upregulated to alleviate the deleterious consequences of oxidant injury. Previous studies have demonstrated that HO-1 expression is increased in experimental diabetic glomeruli, but the functional significance of this increase has not yet been explored. In this study, to elucidate the role of HO-1 in podocyte apoptosis under diabetic conditions, I investigated not only the expression of HO-1 but also podocyte apoptosis in experimental diabetic glomeruli and in high glucose-stimulated cell before and after inhibition of HO activity.

Methods: In vivo, 32 Sprague-Dawley rats were injected either with diluent (n=16, C) or with streptozotocin intraperitoneally (IP) (n=16, DM), and 8 rats from each group were treated with IP Zinc protoporphyrin (ZnPP, 50 ?mol/kg/day), an HO-1 inhibitor, for 6 weeks. In vitro, immortalized mouse podocytes were cultured in media containing 5.6 mM glucose (NG), NG+24.4 mM mannitol (NG+M), or 30 mM glucose (HG) with or without HO-1 siRNA. Real-time PCR for HO-1 mRNA expression and Western blotting for HO-1, Bax, Bcl-2, and active fragments of caspase-3 protein expression were performed with sieved glomeruli and cell lysates. In addition, TUNEL assay and immunofluorescence (IF) staining for active fragments of caspase-3 were conducted with renal tissue and Hoechst 33342 staining with cultured podocytes.

Results: Urinary albumin excretion was significantly higher in DM (1.18±0.11 mg/day) compared to C rats (0.32±0.04 mg/day) (p<0.05), and was further increased in DM rats by ZnPP (1.59±0.19 mg/day) (p<0.05). HO-1 mRNA and protein expression were increased in diabetic glomeruli and in HG-stimulated podocytes, and these increases were inhibited by ZnPP and HO-1 siRNA, respectively. The ratios of Bax/Bcl-2 protein expression were significantly higher in diabetic glomeruli and in podocytes exposed to HG, which were further increased by ZnPP and HO-1 siRNA, respectively. Western blotting with active fragments of caspase-3 showed a similar pattern to the ratios of Bax/Bcl-2 protein expression. TUNEL positive-stained nuclei were also significantly increased in DM (1.3?0.2) compared to C glomeruli (0.4?0.1) (p<0.05), and were further increased in DM glomeruli by ZnPP (2.2?0.3) (p<0.05). In addition, double IF staining with active fragments of caspase-3 and synaptopodin revealed that active fragments of caspase-3 expression was most prominent in podocytes of DM+ZnPP rats. Apoptotic cells assessed by Hoechst 33342 staining were also significantly increased in HG-stimulated podocytes compared to NG cells, which were further increased in HG+siRNA group.

Conclusion: This study suggests that HO-1 expression is increased in experimental diabetic glomeruli and in HG-stimulated podocytes, and the increase in HO-1 expression plays a protective role against podocyte apoptosis under diabetic conditions.