진드기매개뇌염바이러스 (tick-borne encephalitis virus) 분리 및 in vivo에서의 분리주 병원성 분석

Abstract

[한글]

진드기매개뇌염바이러스 (tick-borne encephalitis virus, TBEV)는 Flaviviridae family, Flavivirus genus에 속하는 바이러스로서 심각한 신경질환의 원인이 되는 주요 절지동물매개바이러스 (arboviruses)중 하나이다. 이 바이러스에 의한 진드기매개뇌염 (tick-borne encephalitis, TBE)은 유럽, 러시아 및 아시아 등지에서 유행하며, 이 지역들에서 중요한 공중보건학상의 문제가 되고 있는 질병이다. 아직까지 국내에TBEV에 의한 뇌염환자 발생사례는 없지만, 불명뇌염환자의 증가를 비롯한 우리나라와 인접한 아시아 국가들에서의 바이러스 분리 및 환자보고 사례, 국내 TBEV 매개체 서식 등으로 미루어 볼 때 국내에서도 TBE 발생가능성은 높다고 할 수 있다. 하지만 아직까지 관련연구가 수행되고 있지 않은 실정이다. 본 연구에서는 국내에서 확보한 임상, 숙주 및 매개체 검체를 이용하여 TBEV 감염여부를 조사하였다. TBEV 유전자가 검출된 검체를 대상으로 감수성 세포 및 ICR 마우스를 이용한 바이러스 분리를 시도하여 야생쥐 폐조직 검체로부터 5주의 TBEV를 분리하였다. TBEV 국내분리주의 분자유전학적 특성을 분석하고자 세포배양액으로부터 RT-PCR으로 전체 envelope (E) 유전자를 증폭한 후, 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 이를 기존에 보고된 TBEV 분리주와의 계통유연관계 및 연역된 아미노산 서열을 비교 분석한 결과 국내분리주 5주는 모두 Western 아형에 속했으며 (97%이상의 상동성), Western 아형에서만 특징적으로 나타나는 아미노산 서열이 잘 보존된 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 국내분리주는 TBEV 중 Western 아형의 특징을 가짐을 확인하였고, Sofjin-HO나 Neudoerfl 주와 비교해 E 단백의 domain Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ에서 특정아미노산이 치환됨을 확인하였다.

국내분리주의 E 단백을 구성하는 3가지 domain의 특정 아미노산 치환이 병원성에 영향을 주는지 알아보기 위해 6주령 ICR 마우스를 이용하여 병원성을 표준주와 비교하였다. 그 결과 국내분리주 5주는 표준주인 Sofjin-HO나 Neudoerfl 주에 비하여 neuroinvasiveness와 neurovirulence가 낮았다.

본 연구를 통해서 국내 최초로 야생숙주동물 (야생쥐 폐조직)로부터 TBEV를 분리하였으며, 국내분리주의 낮은 병원성은 E 단백의 특정아미노산 치환과 관련이 있는 것으로 사료된다. 특정아미노산 치환과 병원성의 관련성에 대하여는 향후 추가연구가 요구되며, 본 연구에서 분리된 TBEV 국내분리주의 E 단백 유전자 및 병원성 분석은 TBEV 진단법 개선 및 백신개발을 위한 유용한 정보를 제공할 것이다.

[영문]

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is an arthropod-borne virus belonging to the genus flavivirus within the family Flaviviridae. It is endemic in central Europe, Russia and parts of Asia and represents a significant public health problem in these areas. Although tick-borne encephalitis (TBE) has not been reported in Korea, it seems quite probable that tick-borne encephalitis by TBEV occurred in Korea since an increase of the number of unknown encephalitis patients, distribution of the main vectors of TBEV in Korea and TBEVs have been isolated near the countries including Japan, China and Russia. But TBEV has never been investigated so far in Korea. To investigate whether TBEV is present in Korea, Human, vector ticks and animal hosts were tested to detect and isolate TBEV using RT-nested PCR, cell culture and inoculation into ICR mices. As a result, TBEV were isolated from wild rodents (lung tissue) in Korea. We determined the complete envelope (E) protein genes of five Korean isolates and analyzed the genetic variability within five Korean isolates or with 13 other TBEV strains. Five isolates had high identity with Western subtype (97～99%identity) in nucleotide and deduced amino acid. The phylogenetic analysis showed TBEV isolates from Korea were clustered with Western subtype. Results of deduced amino acid alignment of five isolates conserved unique amino acids as Western subtype strains. It was found from the result that provide the first evidence of the presence of TBEV in Korea and five isolates was characterized by Western subtype.

To identify whether the amino acid substitutions of three domains in E protein associated with neuroinvasiveness and/or neurovirulence, in vivo virulence assay in 6-week-old ICR mice were performed. The results showed both neuroinvasiveness level by subcutaneous inoculation and neurovirulence level by intracerebral inoculation, five Korean isolates were lower than Sofjin-HO and Neudoerfl strains. The amino acid substitution of domain Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ in E protein between five Korean isolates and 2 other TBEV strains (Sofjin-HO and Neudoerfl strain) were identified.

From these studies the precise mutation sites were unable to identify involved in attenuation of neuroinvasiveness and/or neurovirulence of five Korean isolates. However, one or more of the amino acid substitutions in domain Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ may be assumed to the contribute to attenuation of neuroinvasiveness and/or neurovirulence of five Korean isolates. The results of this study will provide a valuable information for the development of an effective vaccine and diagnosis of TBEV.