Regulation of human endothelial nitric oxide synthase mRNA stability through sterol-responsive elements : multiple cis-acting elements and trans-acting factors

Abstract

[한글]

Statin계 약물은 cholesterol 생합성 과정에서 mevalonate 합성 경로의 속도-조절 효소를 억제하므로서 혈중 cholesterol 치를 낮춘다. 따라서, 이 약물들은 심 혈관계 질환 환자 및 이 질병에 걸릴 위험이 큰 사람들에게 흔히 사용된다. 최근들어서, statin계 약물들이 cholesterol 치를 낮추는 것 외에도 다른 작용을 통해서 죽상 경화증을 예방할 수 있음이 보고되고 있다.

본 연구진은 HUVEC에서 유래된 세포주인 EA.hy926을 이용한 실험에서 lovastatin이 eNOS mRNA 치를 증가시킴을 보고한 바 있다. Lovastatin은 mevalonate 및 geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)와 같은 sterol을 세포 내에서 고갈시키므로서 eNOS mRNA을 안정화시켰다. GGPP는 다양한 세포내 신호 전달 단백의 isoprenylation에 필요하므로, lovastatin은 특정한 신호 전달 과정을 억제하므로서 이러한 효과를 나타낸 것으로 생각되었다. 또한, 이 실험에서 eNOS mRNA의 제거율을 조절하는 cis-acting element들이 3’-UTR 및 이에 인접한 부위에 있음이 관찰되었다. 추후 실험에서, Rho-kinase 억제제인 hydroxyfasudil 및 actin cytoskeleton 파괴 물질인 cytochalasin D가 eNOS mRNA 치를 증가시킴이 관찰되므로서, Rho 신호 전달 경로에 의해 조절되는 세포 구조의 상태가 eNOS mRNA의 제거율에 영향을 미칠 수 있음이 제시된 바 있다.

본 실험에서는 eNOS mRNA의 안정성을 조절하는 cis-acting element들의 염기 서열과 정확한 위치를 결정하고자 하였다. CU-rich element에 대응하는 mutant들을 이용한 transfection 실험에서 UCCUC, UUCUC, CUUU, UCCUU, CCUCC, CCUCU가 eNOS mRNA 안정성 조절에 관여함이 관찰되었다. 이들 cis-acting element와 결합하는 trans-acting factor가 존재함을 확인하기 위하여 동위 원소로 표지된 RNA probe과 세포 추출물을 이용하여 RNA-단백 반응 실험을 시행하였다. 이 실험에서 60 kDa riboprobe-단백 복합체가 관찰되었고, lovastatin으로 세포를 전처치하였을 때, 이 riboprobe-단백 복합체의 형성이 증가됨이 확인되었다. 이 단백을 biotin-표지 RNA probe을 이용하여 분리한 후 이차원 겔 전기영동을 시행하였고, Maldi-TOF spectrum 분석에서 이 단백이 β-actin임이 제시되었다. 이상의 실험 결과는 세포내 sterol이 고갈되었을 때, β-actin이 sterol-responsive element (CU-rich element)에 결합하므로서 eNOS mRNA의 안정성을 증가시킴을 제시하고 있다.

[영문]

Statins lower serum cholesterol by inhibiting the rate-limiting enzyme in the mevalonate pathway of cholesterol synthesis. So it is often used as pharmaceutical agents in people with or at risk of cardiovascular disease. There are many reports showing that statins exhibit action beyond lipid-lowering activity in the prevention of atherosclerosis. Previously, we have reported that lovastatin increased the levels of eNOS mRNA at a post-transcriptional level using HUVEC (human umbilical vein endothelial cell)-derived cell line, EA.hy926. Lovastatin stabilized eNOS mRNA by depriving intracellular sterols, including mevalonate or geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP). Because GGPP was required for the isoprenylation of various intracellular signaling molecules, such effect of lovastatin seemed to be mediated by intracellular signaling pathways. In this experiment, either hydroxyfasudil, a Rho-kinase inhibitor, or cytochalasin D, a disrupter of the actin cytoskeleton, upregulated the levels of eNOS mRNA. These data indicated that the status of cellular architecture regulated by Rho-mediated pathways may play a role in determining the decay rate of eNOS mRNA. We also proved that 3´-untranslated regions (3´UTR) and the adjacent coding regions of eNOS mRNA harbored the cis-acting elements necessary to regulate eNOS mRNA decays. In this experiment, we aimed to determine the precise sequences and the exact locations of these cis-acting elements. Several mutants corresponding to CU-rich elements were prepared. Data from transfection experiments showed that six elements, UCCUC, UUCUC, CUUU, UCCUU, CCUCC and CCUCU were functional in the regulation of eNOS mRNA stability. In order to verify the presence of trans-acting factors associated with these cis-acting elements, RNA-protein binding assay using radiolabelled RNA probes was performed and an approximate 60 kDa ribonucleoprotein (RNP) complex was detected. The binding activity of this RNP complex was increased in the presence of lovastatin. In order to determine the identity of this RNA-binding protein, UV-crosslinking studies using biotin-labelled RNA probes and two dimensional gel electrophoresis were performed. Analysis of Maldi-TOF spectrum identified β-actin protein as the major component of this RNP complex. These data indicated that binding of β-actin protein to CU-rich elements played a functional role in the regulation of eNOS mRNA stability. Our results provided a basis for future studies on the mechanisms of regulation of transcripts stability.