전신투여 가능한, HER2 표적지향성, 아데노바이러스의 개발

Abstract

[한글]

HER2/neu는 세포막에 존재하는 성장인자 수용체 (Epidermal Growth Factor Receptor) 중 하나로서 전체 유방암 환자의 20-30%에서 과발현되어 있으며 불량한 예후인자로 알려져 있다. 이러한 HER2/neu를 표적으로 한 신약들이 개발되고 있으며 그 중 대표적인 약제가 Herceptin (Trastuzumab)이다.

아데노바이러스를 이용한 유전자 치료를 항암제로서 사용하는데 가장 큰 문제점은 생체 내 면역반응으로 인하여 전신투여가 어렵다는 점이다. 이러한 문제를 극복하고자 최근 PEG (polyethylene glycol)를 아데노바이러스에 붙이면 (PEGylation) 생체 내 면역 반응을 낮출 수 있고 이는 아데노바이러스의 혈중제거율을 떨어뜨리고 약동학적으로 AUC (area under the curve)를 높여서 전신투여가 가능할 하나의 방법으로 제시되고 있다. 하지만 이러한 PEGylation은 아데노바이러스 주위의 PEG에 의해 아데노바이러스의 세포내로의 접근성이 떨어지는 점이 치료제로 사용하는데 있어서 극복해야 할 문제점으로 제기되고 있다.

본 연구에서는 그 동안 본 연구실에서 암세포 특이적 발현과 함께 암세포 살상능이 극대화 될 수 있도록 개발한, 복제가능 아데노바이러스인 Ad-mTERT-△19-Relaxin을 PEGylation 시킨 후 다시 Herceptin 을 붙여서 삼차원 구조 물질 (ternary structure)을 개발하고 이를 HER2 과발현된 유방암세포주를 대상으로 본 치료제의 in vitro 및 in vivo 효과를 확인하고자 하였다.

아데노바이러스의 PEGylation을 위해 아데노바이러스와 PEG를 연결해주는 cross linker인 Dithiobis (succinimidyl-propionate) (DSP)나 Dithiobis (sulfosuccinimidyl-propionate) (DTSSP)를 유기용매인 Dimethyl sulfoxide (DMSO)나 수용액 용매를 사용하여 PEG와 반응을 시켜서 PEGylated adenovirus (Ad-PEG)를 제작하였다. 그 후 PEGylated adenovirus를 cross linker인1-Ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide (EDC)/N-hydroxy succinimide (NHS)를 이용하여 동결 건조된 단클론항체인 Herceptin과 반응시켜 삼차원 구조물 (Ad-PEG-HER)을 제작하였다.

이렇게 제작된 물질의 정성분석을 위해 FPLC를 통해 분리된 아데노바이러스 (Ad), PEGylated 아데노바이러스(Ad-PEG), 그리고 Ad-PEG에 Herceptin이 부착된Ad-PEG-HER 각각의 크기를 DLS (Zeta-potential Analyzer, Photal, Otsuka, Japan)를 이용하여 측정한 결과 세 물질 모두 크기가 약 100nm 정도였으나 Ad → Ad-PEG → Ad-PEG-HER의 구조로 갈수록 크기가 증가함을 확인하였다. 또한 이들 물질들을 이용하여 세포주들에서의 GFP 발현 정도를 확인한 결과 Ad-PEG는 Ad보다 GFP 발현 정도가 감소되었으나 Ad-PEG-HER는 HER2 과발현 세포주인 NIH 3T6.7, MDA-MB-435, 및 MDA-MB-231 세포주에서는 GFP 발현이 Ad-PEG보다 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 이들 3가지 물질을 이용한 세포독성 실험 (MTT assay)에서도 PEG에 의해 감소된 세포독성이 Herceptin이 추가된 Ad-PEG-HER에서 증가됨이 관찰되었다. 이러한 효과가 HER2/neu신호전달 기전을 매개하여 발생하는지 확인하기 위해 competition assay를 진행하였으며 Herceptin을 미리 처리한 경우는 그렇지 않는 경우에 비해 Ad-PEG-HER의 HER2/neu 과발현 세포주에서의 GFP 발현이 감소되는 것을 확인하여 Ad-PEG-HER가 HER2를 통해 감염이 됨을 간접적으로 알 수 있었다.

Ad-PEG-HER는 BALB/c 마우스에서Ad에 비해 중화항체의 생성이 감소되었는데 이는 PEGylation으로 Ad에 대한 면역학적 반응을 줄여줄 수 있음을 시사하고 있다. 누드마우스 xenograft 모델에서 Ad-PEG-HER는 Ad나 Ad-PEG에 비해 개선된 항종양 효과를 보였지만 통계학적인 유의성은 없었다.

결론적으로, Ad-PEG-HER는 HER2 과발현 유방암 환자에서 치료제로서 가능성 있는 약제라고 판단되며 향후 추가적인 전임상 및 임상연구가 필요할 것이다.

[영문]

HER2/neu is 1 of the 4 known epidermal growth factor receptors and is known to be overexpressed in 20-30 % of breast cancer patients, indicating poor prognosis. New drugs are being developed targeting HER2/neu, and Herceptin (Trastuzumab) is regarded as a representative one at present.

The most well-known obstacle for an adenovirus to be developed as an anticancer drug is the limitation to be delivered systemically because of the in vivo immune response. Recently, conjugation of polyethylene glycol (PEG) to the adenovirus (PEGylation) showed increased circulation time in mice, indicating the possibility of systemic administration of the adenovirus as an anticancer therapeutic. However, PEGylation resulted in decreased viral delivery into the cell because of PEG which is coating the virus outside could prevent the viral contact with the receptors in cell. The current study aimed to increase the systemic viral delivery of this PEGylated adenovirus through by making a ternary structure with Herceptin (trastuzumab) in HER2 positive breast cancer. We used Ad-mTERT-△19-Relaxin as a backbone adenovirus that was developed in our laboratory. It was designed to enhance target specificity using the TERT promoter and increase cellular apoptosis and viral spread through the deletion of the E1B19 gene and the addition of the Relaxin gene in the E3 region. The backbone virus was conjugated with PEG (Ad-PEG) using either dithiobis (succinimidyl-propionate) DSP or dithiobis (sulfosuccinimidyl-propionate) DTSSP as a cross-linker in water or DMSO followed by binding to Herceptin with the cross-linker of 1-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide(NHS), resulting in a ternary structure named Ad-PEG-HER. The mixtures of the adenovirus only, Ad-PEG, and Ad-PEG-HER were segregated respectively using FPLC. The size of each product was measured using DLS (Zeta-poetntial Analyzer, Photal, Otsuka, Japan) and showed particles of around 100 nm in size. The size was larger in Ad-PEG-HER, Ad-PEG, and adenovirus only in that sequence. In terms of GFP expression, Ad-PEG showed decreased gene expression compared to Ad but Ad-PEG-HER showed enhanced GFP expression in HER2 positive cell lines such as NIH 3T6.7, MDA-MB-435, and MDA-MB-231. In MTT assay, Ad-PEG- HER overcame the decreased cytotoxicity of Ad-PEG because of PEGylation. In order to confirm that this effect was mediated through HER2, competition assay was done and showed that Herceptin pretreatment led to decreased GFP expression with Ad-PEG-HER. In a pharmacokinetic study in BALB/c mice, Ad-PEG-HER showed slightly increased circulation time compared to Ad. Analysis of immune response after Ad-PEG-HER treatment showed decreased production of IL-6 and neutralizing antibody. In nude mouse xenograft model, Ad-PEG-HER showed enhanced antitumor acitvity compared to Ad and Ad-PEG when injected systemically but it was not statistically significant. In conclusion, Ad-PEG-HER seems to be a promising therapeutic in HER2 positive breast cancer but further preclinical and clinical studies are needed to explore its potential.