Propidium monoazide와 real-time PCR을 이용한 살아있는 Enterococcus faecalis의 선택적인 검출

Abstract

[한글]

세균의 검출에 있어서 polymerized chain reaction (PCR) 방법은 기존의 plate counting과 달리 빠르게 세균을 검출할 수 있다. 하지만 세균이 죽은 후에도 DNA는 장기간 존재할 수 있기 때문에, DNA에 기초한 분석은 살아있는 세균과 죽은 세균을 구분할 수 없다. 최근에 DNA extraction전에 propidium monoazide (PMA)를 처리하여 살아있는 세균만 선택적으로 검출하는 방법이 제시되었다. PMA는 손상된 세포막만 통과하여 죽은 세포의 DNA와 빛 노출 하에서 결합하여 PCR이 증폭되는 것을 막는다.

Enterococcus faecalis는 근관치료의 실패에 있어서 중요한 원인이 되는 세균으로 제시되어 왔다. 그리고 chlorhexidine (CHX)은 E. faecalis의 제거에 있어서 효과적인 약제임이 밝혀졌다.

이번 실험의 목적은 세균 수의 측정에 있어서, PMA 처리와 real-time PCR 방법의 적용 가능성을 기존의 plate counting과 비교하여 알아보는 것이다. 또한 E. faecalis에 대한 2% CHX의 살균 효과를 PMA 처리 후 real-time PCR 방법을 사용하여 알아보는 것이다.

실험 방법으로 먼저 살아있는 세균과 죽은 세균을 다른 비율로 섞어서 PMA를 처리한 후 real-time PCR을 시행하여 PMA가 빛 노출 하에서 죽은 세균의 DNA와 결합하는 효과를 나타내는지 알아보았다. 다음으로 PMA 처리 후 real-time PCR 방법을 이용하여 살아있는 세균의 양을 측정한 것을 plate counting으로 얻은 CFU와 비교하였다. 마지막으로 2% CHX의 처리시간을 다르게 하였을 때 E. faecalis에 대한 살균 효과를 PMA 처리 후 real-time PCR 방법을 사용하여 알아보았다.

실험 결과로 살아있는 E. faecalis의 비율이 감소할수록 Ct value는 증가하였다. 그리고 PMA 처리 후 real-time PCR 방법을 이용하여 세균의 양을 측정한 것과 plate counting으로 얻은 CFU 사이에는 Optical density (OD) 값이 1.0일 때까지는 상관관계가 있었다. 하지만 OD 값이 1.5일 때는, PMA를 처리한 후 real-time PCR을 시행했을 때 측정된 살아있는 세균의 양이 감소하였음에 반해서 plate counting에 의한 CFU는 계속 증가하였다. 마지막으로 2% CHX을 오래 적용할수록 살아있는 E. faecalis의 상대적인 양이 감소하는 것을 PMA 처리와 real-time PCR 방법을 이용해 확인하였다.

이번 연구를 통해 첫째로 PMA 처리 방법은 죽은 세균을 제외하고 살아있는 세균만 선택적으로 검출한다는 것을 알 수 있었다. 둘째로 기존의 plate counting의 대체 방법으로써 PMA 처리와 real-time PCR 방법을 적용하는 것이 가능하지만, OD 값이 1.5 이상일 때는 한계가 있다. 셋째로 E. faecalis에 대한 CHX의 살균 능력에 있어서, starvation phase 때의 E. faecalis의 제거를 위해서 2% CHX의 장시간 적용이 필요하다.

[영문]

I. Introduction : Polymerized chain reaction (PCR) can detect bacteria more rapidly than conventional plate counting. However DNA-based assays cannot distinguish between viable and dead cells due to persistence of DNA after cells have lost their vitality. Resently, propidium monoazide (PMA) treatment has been introduced. It was used before DNA extraction, resulting in selective DNA detection of viable bacteria. PMA penetrates cells with compromised membranes and intercalates with dead cell DNA upon light exposure, then inhibits PCR amplification.

Enterococcus faecalis has been suggested to be an important etiologic bacteria in endodontic failure. And chlorhexidine (CHX) is effective disinfectant for removal of E. faecalis.

The purpose of this study is to evaluate the applicability of the PMA treatment and real-time PCR method for cell counting in comparison with plate counting and to evaluate the antibacterial efficacy of 2% CHX on E. faecalis using PMA treatment in combination with real-time PCR

II. Materials & Methods : Firstly, to elucidate the relationship between the proportion of viable cells (DNA yield) and the real-time PCR signals after PMA treatment, mixtures with different ratios of viable and dead cells were used. Secondly, relative difference of viable cells using PMA treatment in combination with real-time PCR was compared with CFU by plate counting. Lastly, antibacterial efficacy of 2% CHX on E. faecalis was measured using PMA treatment in combination with real-time PCR.

III. Results : Firstly, Ct value increased with decreasing proportion of viable E. faecalis. Secondly, there was correlation between viable cells measured by real-time PCR after PMA treatment and CFU by plate counting until Optical density (OD) value remains under 1.0. However, viable cells measured by real-time PCR after PMA treatment have decreased at 1.5 of OD value while CFU kept increasing. Lastly, relative difference of viable E. faecalis decreased more after longer application of 2% CHX.

IV. Conclusion : Using PMA treatment, viable cells can be detected selectively from dead cells. Also PMA treatment in combination with real-time PCR can be applied for cell counting. However, it can only be applicable under 1.5 of OD value. Lastly, for removal of E. faecalis in starvation phase, long term application of 2% CHX is needed.