성인 골수 유래 중간엽 줄기세포의 Alkaline phosphatase 활성과 골 분화능의 상관관계

Abstract

[한글]

Alkaline phosphatase (ALP)는 골형성 시스템의 초기 표지자로 알려져 있으나, 성인 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)에서의 정확한 기능에 대해서는 밝혀진 바가 많지 않다. 미분화 중간엽 줄기세포에서 골분화와 연관된 전사인자인 Cbfa1, Osterix, Dlx5, Msx2의 발현이나 역할에 대한 연구 결과는 더욱 드물다. 따라서 본 연구는 첫째, 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 발현되는 ALP와 골 분화능의 상관관계를 규명하고, 둘째, 미분화 중간엽 줄기세포에서 골분화와 연관된 유전자의 발현 양상을 규명하고자 하였다.

연구 방법

20세에서 74세까지, 20여명의 공여자로부터 얻어진 골수액을 7일 동안 배양하였다. 공여자별로 분리한 중간엽 줄기세포의 ALP 활성을 측정하고 ALP 염색을 수행하였다. 또한 Crystal violet 염색을 통하여 colony 형성 능력을 관찰하였다. 골아세포와 지방세포로의 분화를 위하여 골아세포 배지와 지방세포 배지에서 배양한 후, 골아세포는 Von Kossa 염색, 지방세포는 Oil Red O 염색으로 분화 정도를 확인하였다. 또한, 역전사-중합효소 연쇄반응을 통하여 골분화와 연관된 유전자들의 발현 양상을 확인하였다.

결 과

성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 ALP 활성은 각 공여자마다 서로 다를 뿐만 아니라, 한 공여자의 서로 다른 세포군에 따라서도 변이를 보였다. ALP 양성군은 음성군에 비해 골아세포로의 분화가 더 잘 이루어졌고, 지방세포로의 분화는 차이가 없었다. 한 개체 내에서 세포를 크기별로 나누었을 때, 크기가 큰 세포가 상대적으로 높은 ALP 활성도를 나타내었고, 골아세포로의 분화도 더 잘 이루어졌다.

골아 세포로의 분화 과정에서 나타나는 전사인자인 Cbfa1과 Dlx5는 ALP 양성군에서 많이 발현되어 있었고, ALP 음성군에서는 Osterix와 Msx2가 상대적으로 강하게 발현되었다

결 론

중간엽 줄기세포에서 ALP의 활성 정도는 골아세포로의 분화능력과 상관관계가 있음을 확인하였다. ALP의 활성이 상대적으로 높은 세포들은 골 분화와 연관된 전사인자가 많이 발현되고 있었다. 따라서 중간엽 줄기세포 중에서 ALP 활성이 높은 세포들은 골 결손 환자들을 위한 임상적용에 더욱 효과적일 것으로 사료된다.

[영문]

Introduction

Alkaline phosphatase (ALP) is widely accepted as an early marker of osteogenesis in bone-forming system. However, the role of ALP in human mesenchymal stem cells (MSCs) are not clearly understood. Furthermore, although the importance of Cbfa1, Dlx5, Msx2, and Osterix in osteogenic differentiation in MSCs have been reported, little is known about the relationship between their level of expression in undifferentiated stem cells and the osteogenic differentiation. This study focused on characterizing the relationship between ALP activity and differentiation ability of human bone marrow derived MSCs, as well as on the expression patterns of osteogenic-related genes in ALP-positive undifferentiated MSCs.

Methods

Human mesenchymal stem cells were isolated from bone marrow aspirates of healthy adult donors between the age of 20-74 years under the approval of Institutional Review Board (IRB). We measured levels of alkaline phosphatase activity and performed alkaline phosphatase staining in each donor population before osteogenic differentiation. MSCs were were then incubated in an osteogenic medium for 14 days, and then analyzed by Von Kossa staining. MSCs were also incubated in an adipogenic medium for 14 days and analyzed by Oil red O staining.

Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reactions (RT-PCR) were performed to evaluate the expression of ALP, Osteopontin, Cbfa1, Dlx5, Msx2, Osterix in undifferentiated MSCs.

Results

In human bone marrow-derived MSCs, ALP activity was expressed at different levels among donor populations. ALP-positive group showed better differentiation ability to osteoblast compared to ALP-negative group. According to the size of the cells, large cells showed relatively higher level of ALP activity.

RT-PCR analysis showed that Cbfa1 and Dlx5 were expressed at high levels in ALP-positive groups even in their undifferentiated status. ALP-negative groups expressed high level of Osterix and Msx2.

Discussion

ALP-positive cells showed high osteogenic differentiation potential. ALP-positive MSCs highly expressed osteogenic transcription factors (Cbfa1 and Dlx5) and osteoblastic markers (ALP and Osteopontin), but not Msx2 or osterix compared to ALP-negative MSCs. This suggests that Msx2 or Osterix might play a role as a negative regulator in osteogenesis of human bone marrow-derived MSC. Therefore, ALP+/Msx2-/Osterix- can be a useful marker in selecting MSCs with high osteogenic potential.