Molecular mechanism of KIT and PDGFRA mutation and HMGB1 activation in the tumorigenesis of gastrointestinal tumors

Abstract

[한글]

위장관간질종양은 위와 장에 발생하는 대표적인 간엽성 종양 (mesenchymal tumor)으로 현재까지 수행된 분자유전학적 연구결과에 따르면, 약 41~92%의 위장관간질종양에서 v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog (KIT) 종양형성유전자의 gain-of-function 돌연변이가 있음이 확인되었다. 최근 연구에 따르면 KIT 유전자 변이가 없는 위장관간질종양 중 일부에서 동일한 receptor tyrosine kinase III 그룹에 속하는 platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRA) 유전자의 활성변이가 있음이 관찰되었으며 이러한 두 유전자의 활성변이는 상호배타적으로 일어나는 현상임이 보고되었다. 두 유전자의 변이는 위장관간질종양의 발암과정에서 비슷한 생물학적 결론을 도출해 낼 것으로 예상되고, 실제 주요한 신호전달경로의 활성이 동일하게 일어남이 밝혀졌다. 그러나 이들 유전자의 변이가 위장관간질종양에서 종양 발생 및 진행과정에 미치는 명확한 기전 및 관련 인자에 관한 연구는 아직 부족하다. 뿐만 아니라 위장관간질종양에서 KIT 과 PDGFRA 변이 상태에 따라 종양세포의 형태나 크기, 분열능 등의 임상병리학적 특징 및 약물치료에 대한 반응도의 차이가 있음이 알려짐에 따라, 각각의 유전자 특이적이 신호전달경로의 규명이 필요하게 되었다.

본 연구에서는 위장관간질종양에서 KIT 및 PDGFRA 유전자의 변이 및 여러 임상유전학적 특성에 따른 전사체 및 단백의 체계적 검증을 위하여 전체 23예의 위장관간질종양 환자의 조직을 대상으로 22예의 조직에서는 microarray 검사를 수행하고, 12예에서는 이차원적 전기영동 기술을 이용한 프로테옴 분석을 수행하였다. KIT 및 PDGFRA 유전자 돌연변이 양상에 따라 해당 유전자의 전사체 및 단백질 발현 양이 증가하였고, 각 유전자 돌연변이 양상에 따라 활성화 되는 하부신호 전달기전에 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 또한 돌연변이 양상에 따라 발현 양상의 차이를 보이는 70개의 전사체 및 15개의 단백질을 발굴하였다.

이와 함께 위장관간질종양의 진행에 관련된 분자적 기작을 확인하기 위해 악성도에 따라 발현 차이를 보이는 단백질을 분석한 결과 고위험군 (high risk)에 속하는 위장관간질종양에서 과발현 양상을 보이는 5개의 단백질 (Annexin V, HMGB1, C13orf2, Glutamate dehydrogenase 1과 Fibrinogen beta chain)을 발굴하였다. 이중 모든 위장관간질종양에서 발현되며, non-histone 핵 단백질의 일종으로 전사인자와 상호작용하여 세포의 이동에 관여한다고 알려진 HMGB1 단백질이 초저위험군 (low risk)에 비해 고위험군 (high risk)에서 2.35배 이상의 과발현 되었다. 특히 정상 대조조직과의 비교를 통해 HMGB1의 과발현과 세포질에 존재함을 위장관간질종양과 대장암에서 확인하였다. 이러한 암세포 내 HMGB1 단백의 위치 변화는 암 세포주를 통한 벡터 트랜스펙션과 약물처리 실험을 통해 PKC-δ에 의한 HMGB1의 인산화에 기인된 것 임을 관찰하였고, 인산화된 HMGB1 단백질은 결국 세포 밖에서 검출되었으며, 세포밖에 HMGB1을 투여한 경우 암세포의 침윤 등이 증가함을 확인하였다.

결론적으로 본 연구는 위장관간질종양에서 유전자 발현 패턴과 단백질체 발현을 분석함으로써 유전자 변이와 임상병리학적 특성에 따라 구분되는지는 요소를 확인하였다. 이 중 변이 상태에 따라 발현이 의미 있게 변화한 유전자들을 동정하고, 활성화된 단백질 패턴을 분석함으로써 유전자 특이적인 신호체계를 확인함으로써 이들 유전자가 암 진행에 미치는 영향 및 기능을 일부 확인하였다. 또한 암조직에서 과발현 하는 핵단백질인 HMGB1은 PKC 경로로 인산화되어 핵에서 유리되어 세포질로 이동하고, 궁극적으로는 세포외부로 배출되어 암세포의 침윤과 이동을 증가시키는 인자로 작용함을 밝혔다. 이러한 연구결과는 KIT과 PDGFRA 유전자의 작용 기작 및 RTK의 신호전달경로를 밝혀냄으로써, 위장관간질종양 뿐만 아니라 다른 암에서의 임상적, 병리학적, 분자생물학적 특징에 따른 특화된 암 치료법 개발에 기여하리라 사료된다.

[영문]

Activating mutations of KIT and platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRA) are known to be alternative and mutually exclusive genetic events in the development of gastrointestinal stromal tumors (GISTs) through similar pathways; however the specific downstream pathways and their impact on the gene expression profile have not been evaluated. In order to investigate the molecular characteristics of GISTs according to mutation status and genetic features, gene and protein expression profiles in 23 GISTs were analyzed using oligonucleotide microarray containing 18,665 human oligolibrary, and two-dimensional electrophoresis and matrix-associated laser desorption ionization mass spectrophotometry-time of flight, respectively. The mutation status of KIT and PDGFRA was directly related to the expression levels of activated KIT and PDGFRA, and was also related to the different expression levels of activated proteins that play key roles in the downstream of the receptor tyrosine kinase III family. To evaluate the impact of mutation status and the importance of the type of mutation in gene expression and clinical features, microarray-derived data from 22 GISTs were interpreted using a principal components analysis (PCA). Three relevant principal components, representing mutation of KIT, PDGFRA and chromosome 14q deletion were identified from the interpretation of the oligonucleotide microarray data with the PCA. After supervised analysis, there was at least a 2-fold difference in expression between GISTs with KIT and PDGFRA mutation in 70 genes.

Comparative analysis of the respective spot patterns using two-dimensional electrophoresis showed that 15 proteins were differently expressed the according to mutation status. Expression levels of Septin and Heat shock protein 27 were increased in GISTs with KIT mutations, Keratin 10 was overexpressed in GISTs with PDGFRA mutations, and Annexin V was overexpressed in GISTs lacking either mutation. When we compared these 15 proteins to tumor grade, 5 proteins (Annexin V, HMGB1, C13orf2, Glutamate dehydrogenase 1, and Fibrinogen beta chain) were overexpressed in malignant GIST relative to benign GIST, while, RoXaN protein levels were lower in malignant GIST. HMGB1 is a non-histone nuclear factor protein that interacts with several transcriptions factors and plays a role in tumor metastasis after secretion. All of the 12 GISTs expressed HMGB1 and especially, malignant GISTs showed more than 2.35 times higher expression level than the benign GISTs.

These findings demonstrate that mutations of KIT and PDGFRA affect some different gene and protein expressions, and can be used for the molecular classification and diagnostic biomarker of GISTs. The overexpression of HMGB1 is common in high grade GISTs, and may play a role in the tumorigenesis of GISTs because overexpressed HMGB1 can accelerate genes related to tumor growth and invasion.