Restoration of cardiac function using ex vivo expanded endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood in rats with acute myocardial infarction

Abstract

[한글]

급성 심근경색증은 심혈관계 질환에서 가장 중요한 질환의 하나이다. 최근 그 유병률과 발병률이 증가하고 있으며 심근경색을 치료하기 위해 많은 치료법이 소개되고 있다. 최근에는 심근경색증에 줄기세포를 이용한 새로운 시도가 이루어지고 있으며, 전세계적으로 다른 장기에 비해 비교적 많은 연구가 진행되고 있으나 임상적용은 자가골수세포나 자가단핵구세포를 이식하는 정도에 국한되고 있다. 그러나 아직 동종세포이식에 따르는 면역거부반응이 해결되지 않았고 골수에 존재하는 골수세포를 심장조직에 이식하였을 때 어떻게 심장기능 재생에 기여하는지에 대한 기전이 정확히 규명되지 않은 상태이기 때문에 임상적용 확산에는 한계가 있고 아직도 많은 동물 실험을 통한 선행연구가 필요한 상태이다. 심근경색 후 심 기능 회복에는 혈류개선이 중요한데 이를 위해 단순한 골수세포 이식보다는 골수세포 유래 내피기원세포와 중간엽줄기세포로 분화시켜 이식하는 것이 좀더 효과적일 것이라는 가설로 심장 세포치료분야의 새로운 세포 원으로 시사 되고 있다.또한 많은 환자를 대상으로 한 세포치료제라 함은 동종세포 이식이 가능해야 한다. 제대혈은 이미 골수 이식에서 확인된 바 있듯이 다른 세포 공급원에 비해 미성숙의 줄기세포가 풍부함과 동시에 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 능력과 면역거부반응이 골수세포에 비해 낮다. 따라서 본 연구에서는 치료 세포 공급원으로 제대혈을 이용하여 1) 제대혈로부터 내피기원세포와 중간엽줄기세포를 분리 배양하는 기술을 확립하였고 2) 이들 세포를 유세포분석법, 면역조직화학염색법 등을 이용하여 그 특성을 확인하였다. 3) 그 다음 단계로 분리한 내피기원세포와 중간엽줄기세포를 급성심근경색 SD 쥐 모델에 이식하여 이식 후 4주 뒤에 심 초음파 검사로 기능을 평가한 후 희생하여 면역조직화학검사로 심 조직 기능개선을 평가하였다. 연구 구성은 각 세포의 조직 재생을 보기 위해 혈관재생에 관여하는 내피기원세포 이식군, 심근의 재생을 기대하는 중간엽줄기세포 이식군과 두 세포의 상승효과를 기대하기 위해 두 세포를 동시에 이식한 혼합 이식군으로 나누어 실험을 진행하였다.본 연구 결과 인간 제대혈 유래의 내피기원세포와 중간엽줄기세포는 급성심근경색 쥐 모델에서 심근경색부위 두께를 증대 시키고 심근경색의 면적과 좌심실의 수축기말 용적을 줄여주고 박출 계수가 증가된 효과를 확인할 수 있었다. 또한 제대혈 유래의 내피기원세포와 중간엽줄기세포는 모두 대조군에 비해 심근경색의 치료에 기여하고 심장 기능을 개선해줄 수 있음을 확인하였다. 그러나 두 세포를 동시에 이식한 군이 내피기원세포나 중간엽줄기세포 만을 단독으로 이식한 경우보다 심근기능의 상승효과가 적었는데 이는 두 세포 이식의 상승효과보다는 세포농도를 맞추기 위해 단독 투여군에 비해 세포수를 반씩 이식하였던 점, 또는 상승효과보다는 두 세포 사이의 경쟁유도에 의한 거부반응효과 등을 예측할 수 있으나 이에 대한 확인 실험은 진행하지 않았다. 다만 제대혈 유래의 내피기원세포가 다른 군에 비해 가장 효과적인 치료 결과를 나타낸 것은 본 연구에서 선택한 동물모델이 급성 심근경색 모델이었기 때문으로 혈류개선이 기능회복에 가장 중요한 역할을 했을 것으로 평가하였다. 또한 본 연구는 사람의 제대혈유래 세포를 쥐에 이식한 이종간 이식이었으나 면역억제제를 사용하지 않았음에도 불구하고 면역거부반응이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.결론적으로 본 연구에서는 제대혈 유래 내피기원세포나 중간엽줄기세포 이식은 면역거부반응을 보이지 않았으며, 심 기능 재생에 우수한 효과가 있음을 보여주었다. 특히 체외 증폭한 내피기원 세포의 이식으로 발달된 모세혈관 생성이 급성 심근경색 중에서 가장 효과적인 세포치료법임을 확인하였다.

[영문]

Background: Many researchers have made lots of attempts, in order to restore the heart function from cardiac infarction. Recently, a kind of novel cell therapy has become an acceptable source of treatment methods for cardiac functional disorder and endothelial progenitor cells (EPC) and mesenchymal stem cells (MSC) especially represent a promising tool for new clinical concepts in cellular therapy. Human umbilical cord blood (hUCB) not only contains abundant immature stem/progenitor cells more than other adult stem cell source, but also have a remarkable capacity of differentiating into many types of tissue cells. To examine whether hUCB derived EPC and MSC restore the cardiac function in acute myocardial infarction (AMI), we isolated, expanded and characterized the hUCB derived EPC and MSC in vitro and performed in vivo animal experiments given cell transplantation.Methods: The hUCB was collected in sterile blood bags containing CPDA-1 from normal full-term deliveries. Mononuclear cells (MNC) were isolated using Ficoll-Hypaque, and plated MNC on the fibronectin coated six well culture dishes. Among adherent cells we isolated and ex vivo expanded the EPC and MSC. The characterization of cells was performed by flow cytometric analysis and immunohistochemical stains. hUCB derived EPC, MSC and combination of both (1:1) in endothelial cell basal medium were directly intramyocardially transplanted into the scar of a 1 hour old myocardial infarction in Sprague-Dawley rat at 5x106 cells/50 µl each group. The same volume of cell free medium was used as control. After 4 weeks, their effect on left ventricular (LV) ejection fraction and other related parameters were assessed using echocardiography. Then all the rats were sacrificed for histological and immunochemical examinations 4 weeks post AMI, including measurement of capillary density, infarct area and wall thickness.Results: Transplantation of hUCB derived EPC and MSC can increase the thickness of the infarct area and LV stroke volume, decrease LV end-systolic volume, and improve LV ejection fraction in a rat model of AMI. Interestingly, we found that hUCB derived EPC and MSC all can significantly contribute to the repair of infarcted myocardium and improve the heart function compared to control group. The transplantation of ex vivo expanded EPC to the infarcted myocardium showed significantly better recovery compared to the MSC or EPC/MSC combined cell injection group. In addition, the effect of MSC injection is better than the EPC/MSC combined cell injection group.Conclusion: We have isolated EPC and MSC from hUCB and successfully transplanted in animal experiments. Our results demonstrate that the ex vivo expanded EPC recruitment and blood supply might play a critical roles in the early restoration of heart function in AMI of rat.