In vitro and in vivo effects of sFRP3 overexpressed by Phi C31 integrase strategy on bone

Abstract

[한글]

Wnt signaling은 여러 가지 mechanism을 통해 bone mass를 증가시킨다. Secreted frizzled related proteins (sFRPs)는 transmembrane과 cytosolic domains을 갖고 있지 않지만 Wnt의 decoy receptors로서 Wnt와 결합하여 Wnt/frizzled signaling pathway를 억제하는 작용을 한다고 알려져 있다. 하지만, 최근 여러 연구에 의하면 Wnt의 억제제로 알려진 sFRP3가 생체 외에서 osteoblast 의 증식을 억제하고 분화를 촉진한다는 것이 보고되고 있다. 이에 본 연구에서는 비 바이러스성 유전자전달체계인 Phi C31 integrase를 이용해 sFRP3를 7주 된 ICR mice (male)에 10주간 주입시켜 생체 내와 외에서 sFRP3를 과발현 시킴으로써 뼈에 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하고자 하였다. 골밀도와 골강도 및 골구조학적변화를 각각 관찰하였으며 뼈에 대한 작용기전을 알아보고자 생체 외 실험으로 세포증식, 분화 및 signal을 각각 관찰하였다.Phi C31 integrase를 이용한 sFRP3의 생체 내 과발현은 마우스 간에서의 PCR 과 confocal microscopy로 확인하였으며 ELISA분석으로 혈액 내의 sFRP3 단백질의 발현을 확인하였다. sFRP3 과발현군에서 PIXImus로 대퇴골 골밀도를 분석해 본 결과 대조군에 비해 현저하게 증가하였고, 골구조학적변화를 관찰하기 위한 μCT에서는 sFRP3 과발현군에서 대조군에 비해 BV/TV과 trabecular number가 증가하였으며 반대로 trabecular separation은 감소되였다. 또한 대퇴부 골강도를 측정하기 위해 three point bending test를 시행해 본 결과 maximum load와 stiffness의 값이 sFRP3 과발현군에서 대조군에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였다. sFRP3에 의한 골형성 촉진의 기전을 알아보기 위하여 생체 외 실험으로 preosteoblast cell line인 MC3T3E1 세포와 mesenchymal cell line인 C3H10T1/2 세포를 각각 배양하여 세포의 증식 (proliferation) 과 분화 (differentiation) 및 apoptosis를 분석해 본 결과, sFRP3는 apoptosis를 유도하지 않으며 Wnt3a에 의한 세포증식을 억제한다는 것을 알 수 있었다. 반대로 조골세포로의 분화를 real time PCR을 이용해 체크해 본 결과, Wnt3a는 C3H10T1/2 세포에서는 분화를 억제하고 MC3T3E1에서는 COL1과 ALP를 증가시켰으며 반대로, Wnt5a는 C3H10T1/2 세포에서는 분화를 촉진하고 MC3T3E1세포에서는 분화를 억제한다는 결과를 얻었다. 한편 sFRP3는 두 가지 세포 모두에서 조골세포의 분화 gene인 collagen type 1 (COL1) 과 alkaline phosphatase (ALP)를 현저하게 증가시켰다. 또한 Wnt3a와 Wnt5a의 상기 작용은 sFRP3를 줌으로써 조골세포의 분화 gene인 COL1과 ALP가 증가되었다. sFRP3가 어떤 가능한 signal을 거쳐 상기 효과를 나타내는 지를 알아보고자 sFRP3 단독 처리 후 canonical β-catenin signal 및 noncanonical calcium signal을 각각 조사하였던 바 sFRP3는 상기 signal과 무관하게 조골세포에 작용하는 것을 알 수 있었다.결론적으로 우리는 sFRP3의 생체 내 과발현에 의한 전신 효과로 골밀도 증가, 골의 미세구조 개선 및 골강도를 증가시킴을 관찰하였다. 본 연구에서 sFRP3에 의한 뼈에 대해 긍정적인 효과 (positive effects)를 나타내는 기전은 명확하게 규명하기 어려웠으나, 생체 외 실험에서 sFRP3가 조골세포의 증식은 억제하면서 분화는 촉진함을 알 수 있었다. 그러나 향후, sFRP3에 의한 상기 효과가 Wnt 신호조절 과정의 어떤 단계를 조절함으로써 나타나는 지 또는 독자적인 작용에 의한 것인 지에 대하여서는 좀 더 연구가 필요할 것으로 사료되었다.

[영문]

Wnt signaling increases bone mass through several mechanisms. Secreted frizzled related proteins (sFRPs) do not have transmembrane and cytosolic domains, thus they bind and act as decoy receptors for Wnt proteins and antagonize the Wnt/frizzled signaling pathway. However, previous studies reported that sFRP3 decreased osteoblast proliferation and increased osteoblast differentiation. Because TG or KO mice models regulating Wnt signaling may alter bone development, it is more desirable to evaluate the effects of sFRP3 in skeletally mature animals with pharmacological dose of sFRP3 by overexpressing through non viral gene therapy strategy. sFRP3 was overexpressed by ΦC31 integrase strategy in 7 weeks old ICR mice (male) for 10 weeks to demonstrate the effects of sFRP3 on bone. sFRP3 expression in liver was documented by PCR and confocal microscopy analysis. Serum sFRP3 was detected at ~ μg/mL range by ELISA. In sFRP3 overexpressed mice, femur bone mineral density (BMD) measured by DXA (PIXImus) was higher and both BV/TV and Trabecular number measured by μCT were greater and trabecular separation (Tb.Sp) was less than control mice. Furthermore, three point bending test revealed the remarkable increase in maximum load and stiffness of femurs. sFRP3 inhibited cell proliferation directly or by suppressing Wnt3a mediated stimulating effects or by enhancing Wnt5a mediated inhibitory effects on cell proliferation. Meanwhile sFRP3 stimulated mRNA expressions of collagen type1 (COL1) and alkaline phosphatase (ALP), Wnt3a or Wnt5a independently. sFRP3 inhibited Wnt3a mediated canonical β-catenin signaling pathways, while sFRP3 alone did not affect canonical β-catenin signals or Ca2+ flux at all. In conclusion, systemic overexpression of the sFRP3 in mice improved BMD, microarchitecture and bone strength through regulating proliferation and differentiation of mesenchymal cells and preosteoblastic cells, Wnt3a/Wnt5a dependently and independently.