Identification of differentially regulated genes in blood-fed Anopheles sinensis

Abstract

[한글]

모기의 흡혈은 생식 및 말라리아와 같은 병원체의 전달을 위해 꼭 필요한 행위이며, 흡혈 시 모기체내에서 복잡한 분자적 변화가 시작된다. 이런 흡혈에 따른 많은 분자적 변화들은 모기나 이를 통해 전파되는 말라리아를 포함하는 모기매개 기생충들에게 중요한 과정이며, 이런 분자적 변화의 양상을 연구하는 것은 매우 중요한 일이다. 따라서 한국의 매개모기인 중국얼룩날개모기를 재료로 모기의 흡혈 여부로 달리 발현되는 유전자를 규명하고자 하였다. 흡혈 후 24시간 지난 흡혈모기와 당섭취 모기의 total RNA를 재료로 ACP (Annealing Control Primer)-based PCR과 Microarray 분석을 수행하였다. ACP-based PCR 결과, 흡혈 모기에서만 유전자 발현이 3배 이상 증가되는 DEG (Differentially Expressed Gene)를 총 68개 얻을 수 있었으며, 이 중 34의 DEG를 TOPO TA 클로닝 벡터에 클로닝하고 염기 서열 분석을 하였다. 분석한 염기 서열은 EMBL과 GenBank database에서 상동성 검색을 수행한 결과, 6개의 DEG (1, 2, 2-3, 4, 5 and 110-3)는 열대열 말라리아의 주매개모기인 An. gambiae의 odorant-binding protein를 encoding하고 있었다. 이 단백질은 잠재적 모기 억제제로서 표적 단백질로 중요성이 있는 것으로 알려진바 있다. 또한 DEG 3과 DEG 110-2는 innate immune response에 중요한 물질로 알려진 peritrophin A와 peroxidase와 각각 상동성을 가졌다. 그 외에 hsp70 heat-shock system과 관련이 있는 DnaJ, 그리고 cytochrome c oxidase subunit IV, Cu+2/Zn+2 superoxide dismutase, cathepsin b, ribosomal protein S4E, 45kDa immunophilin FKBP45, serine/threonine protein kinases, hydroxymethyltransferase, aryldialkylphosphatase, ADP/ATP carrier protein 2, DNA polymerase III gamma/tau subunits, vasa-like protein과 상동성을 가지는 단백질로 밝혀졌다. 흡혈시 발현의 차이를 보이는 유전자 정보를 더욱 많이 밝히기 위해, 2002년에 완성된 Anopheles gambiae genome 자료를 이용하여 cDNA microarray를 제작하고, 8,467 gene transcripts의 발현 양상을 분석하였다. 그 결과, 흡혈 모기에서 7배 이상의 발현이 증가 또는 감소되는 139 cDNA의 정보를 알 수 있었다. 95개의 cDNA는 흡혈시 발현이 up-regulation되었으며, 36개의 cDNA는 down-regulation되었다. 흡혈시 발현이 up-regulation되는 유전자는 주로 혈액을 소화하거나 (trypsin, chymotrypsin, serine protease, aminopeptidase), peritrophic matrix를 형성하거나 (chitin-binding peritrophin A), 화학주성 system (odorant-binding protein) 또는 embryogenesis와 vitellogenesis에 관련된 유전자들이었다. 이런 결과들은 한국의 말라리아 매개 모기인 중국얼룩날개모기의 분자적 연구에 새로운 이해를 다지는 초석이 될 것이다.

[영문]Blood feeding, or hematophagy, is a behavior exhibited by female mosquitoes required both for reproduction and for transmission of pathogens. Identification of the genes that are differentially expressed between blood-fed mosquitoes and sugar-fed mosquitoes is very important for understanding the molecular basis of malaria vector mosquitoes. The patterns of differentially expressed gene (DEG) analyzed by annealing control primer (ACP)-based PCR and cDNA microarray in adult female Anopheles sinensis at a day following completion of the blood-fed and compared their expression to transcript levels in sugar-fed mosquitoes. Using the technique of ACP-based PCR, we isolated 68 differentially expressed genes (DEGs) that are expressed in blood-fed mosquitoes at least three-fold above as compared to sugar-fed mosquitoes. Thirty-four from 68 DEGs were cloned and sequenced. Twenty-six DEGs showed homology to genes of An. gambiae and Aedes aegypti. Six DEGs (1, 2, 2-3, 4, 5 and 110-3) encoded an odorant-binding protein. Interestingly, DEG 3 and DEG 110-2 were found to encode a chitin-binding peritrophin A and peroxidase, respectively. These proteins were believed to play a role in innate immune response of the mosquito vector. Other DEGs match with various proteins, including Cu+2/Zn+2 superoxide dismutase, cathepsin b, DnaJ, serine/threonine protein kinases, serine hydroxymethyltransferase, aryldialkylphosphatase, ADP/ATP carrier protein 2, DNA polymerase III gamma/tau subunits and vasa-like protein. Then, we determined the expression patterns of 8,467 gene transcripts by cDNA microarrays prepared using the Anopheles gambiae genome data (2002) in blood-fed adult female An. sinensis and compared their expression to transcript levels in sugar-fed mosquitoes. In blood-fed mosquitoes, 139 cDNAs were expressed at least seven-fold above or below their levels in the sugar-fed mosquitoes. The 139 cDNAs were found to represent 131 unique mosquito transcripts. More unique transcripts are up-regulated than down-regulated in response to blood feeding: 95 are up-regulated at least sevenfold and 36 are down-regulated at least sevenfold. Differentially expressed gene products up-regulated in the blood-fed mosquitoes were involved in the digestion of blood (trypsin, chymotrypsin, serine protease, aminopeptidase), formation of peritrophic matrix (chitin-binding peritrophin A), chemosensory system (odorant-binding protein), embryogenesis and vitellogenesis (vitellogenin). Importantly, increased understanding of An. sinensis biology at the molecular level may open new avenues for intervention against malaria transmission.