양막 및 제대에서 유래된 줄기세포로부터 간세포로의 분화

Abstract

[한글]

성체줄기세포 중 골수에서 분리된 중간엽 줄기세포는 조혈작용을 지지하고 연골, 뼈, 지방조직 등의 다양한 조직으로 분화될 수 있어 세포 기초 치료와 조직 생성 촉진의 중요한 세포원으로 인식되어져왔다. 최근에는 골수 이외에도 다른 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다는 것이 보고되고 있다. 양막이나 제대는 분만 시 쉽게 채취할 수 있고 배아줄기세포에서만 발현되는 여러 유전자가 발현될 뿐 아니라 골수보다 분화력이 뛰어나며 냉동보관이 가능하고 비교적 쉽게 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서는 양막 및 제대 조직에서 분리, 배양한 줄기세포의 특성을 조사하고 간세포 분화 유도 배양조건을 확립하여 양막 유래 줄기세포(human amnion-derived stem cells, HAM)와 제대 유래 줄기세포(human umbilical cord-derived stem cells, HUC)의 간세포로의 분화가능성을 비교하였다.연구에 사용된 양막 및 제대는 산모의 동의아래 만삭 정상 산모로부터 제왕절개 또는 질식 분만 후 채취하여 실험에 사용하였다. 양막과 제대에서 줄기세포를 분리, 배양 후 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 세포면역화학 분석 및 중배엽성 세포로의 분화능 실험을 시행하였다. 또한 양막과 제대에서 유래한 줄기세포를 간세포로 분화 유도 후 간세포 특이 유전자 발현, 알부민 분비 측정, 요소 합성 측정, 인간 알부민에 대한 면역블로팅과 세포면역화학염색법 그리고 PAS 염색을 시행하였다.1. 양막유래 줄기세포와 제대유래 줄기세포에서 Oct-4, SCF, FGF-5, NCAM, nestin, vimentin, CK18, GATA-4, BMP-4, HNF-4α, HLA ABC, HLA DR의 유전자가 발현되는 것을 RT -PCR 방법으로 확인하였다. 간세포로의 분화유도 전에 제대유래 줄기세포는 CK18, BMP-4, HNF-4α, CYP3A4, α1-AT, HNF-1α, PEPCK, CX32 그리고 transferrin 유전자가 발현되었고 양막유래 줄기세포는 CK18, BMP-4, HNF-4α, CYP3A4 그리고 α1-AT 유전자가 발현되었다.2. 세포 면역화학적 분석 결과 양막유래 줄기세포는 collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α-SMA, vimentin, desmin, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 그리고 HLA ABC 단백질이 발현되었다. 제대유래 줄기세포는 는 collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α-SMA, vimentin, desmin, SSEA-3, SSEA-4, vWF 그리고 HLA ABC의 단백질이 발현되었다.3. 양막 및 제대유래 줄기세포로부터 지방세포, 골아세포, 연골세포로 분화되는 것을 관찰함으로서 줄기세포로서의 조직 다분화능을 확인하였다.4. 간세포로의 분화 유도 시 알부민 합성 분비와 요소 합성의 농도가 제대유래 줄기세포에서 양막유래 줄기세포보다 높게 측정되었다. 제대유래 줄기세포는 분화 배양조건 중에서 DM4 배양액에서 간세포로 가장 잘 분화하였다.5. SDS-전기영동, 면역 블로팅 결과 간 분화 유도 전 제대유래 줄기세포에서는 알부민이 분비되지 않았으나, 분화 유도한 세포에서는 알부민이 분비되었다.6. 세포면역화학염색 방법을 이용하여 간세포로 분화한 제대유래 줄기세포내에 인간 알부민이 존재함을 직접 검증하였다.7. PAS 염색을 하여 분화 유도 전 제대유래 줄기세포에서는 글리코겐의 축적이 관찰되지 않았으며, DM4에서 분화를 유도한 세포는 글리코겐이 축적되는 것을 관찰 할 수 있었다.이상의 결과로부터 본 연구에서는 제대나 양막에서 얻은 줄기세포로부터 간세포로의 분화를 유도하였으며, 두 줄기세포 중 제대에서 얻은 줄기세포가 양막에서 얻은 줄기세포보다 간세포로의 분화 유도가 더 잘됨을 확인하였다. 또한 여러 분화 배양조건으로 간세포 분화를 유도하였을 때 간세포로의 분화 유도가 가장 잘되는 배양조건도 제시할 수 있었다.결론적으로 줄기세포로부터 분화유도 된 간세포를 골수 유래 중간엽 줄기세포가 아닌 제대나 양막으로부터 얻을 수 있게 됨으로서 본 연구가 향 후 간 질환 환자에게 줄기세포 치료에 도움이되고, 제대나 양막 등으로 줄기세포원을 확대함으로서 간세포 획득 방법에 좋은 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]Among adult stem cells, mesenchymal stem cells isolated from bone marrow have been considered an attractive means of cell‐based treatment and tissue formation because they support hematopoiesis and can be differentiated into various tissues including cartilage, bone and fat tissue. Recently it has been found that mesenchymal stem cells can be isolated from tissues other than bone marrow. Amnion and umbilical cord are easily obtainable and they express various genes known to be expressed only in embryonic stem cells. In addition, they show higher differentiation ability than bone marrow and can be stored frozen conveniently, and it is relatively easy to isolate mesenchymal stem cells from them. The present study investigated the characteristics of stem cells isolated from the tissues of amnion and umbilical cord and cultured, established culture conditions for inducing their differentiation into hepatocyte-like cells(HLC), and compared the possibility of the differentiation of stem cells derived from human amnion and umbilical cord into HLC. Amnions and umbilical cords used in the research were collected from Caesarean section or vaginal delivery of normal term women under their consent, and were used in the experiment. After stem cells were isolated from the amnions and umbilical cords and cultured, we performed RT‐PCR, immunocytochemical analysis, and experiment on differentiation into mesodermal cells. After inducing the differentiation of human amnion-derived stem cells (HAM) and human umbilical cord-derived stem cells (HUC) into HLC, we examined the expression of hepatocyte specific genes, measured albumin secretion and urea synthesis, and conducted immunoblotting, immunocytochemical staining and PAS staining.1. According to the results of RT‐PCR, HAM and HUC were found to express genes such as Oct‐4, SCF, FGF‐5, NCAM, nestin, vimentin, CK18, GATA‐4, BMP‐4, HNF‐4α, HLA ABC and HLA DR. In HUC before induction of differentiation into HLC were expressed CK18, BMP‐4, HNF‐4α, CYP3A4, α1‐AT, HNF‐1α, PEPCK, CX32 and transferrin gene, and in HAM were expressed CK18, BMP‐4, HNF‐4α, CYP3A4 and α1‐AT gene.2. According to the results of immunocytochemical analysis, in HAM were expressed collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α‐SMA, vimentin, desmin, SSEA‐3, SSEA‐4, TRA‐1‐60 and HLA ABC protein. In HUC were expressed collagen I, II, III, IV, XII, fibronectin, CD44, CD54, α‐SMA, vimentin, desmin, SSEA‐3, SSEA‐4, vWF and HLA ABC protein.3. It was observed that HAM and HUC differentiated into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes.4. In differentiation into HLC, HUC showed higher secretion of albumin protein synthetic and higher concentration of urea synthetic than HAM. HUC differentiated into HLC most efficiently in DM4 medium among differentiation culture conditions.5. According to the result of SDS‐electrophoresis and immunoblotting, HUC before the induction of differentiation into HLC did not secrete albumin but those after the induction of differentiation secreted albumin.6. Using immunocytochemical staining, we proved that human albumin exists in cells differentiated into HLC.7. Through PAS staining, we observed that glycogen was not accumulated in HUC before the induction of differentiation but it was accumulated in cells after the induction of differentiation in DM4.Through the results of this study presented above, HUC are more likely to differentiate into HLC than HAM. In addition, we induced differentiation into HLC under several differentiation culture conditions in order to find the culture condition most efficient for inducing HUC to differentiate into HLC. Further research is required to establish the optimal condition for differentiating HAM and HUC into HLC, and such a study is considered to contribute to stem cell treatment and improve the effect of HLC transplantation for liver disease patients.