The effects of sonophoresis on the expression of hyaluronic acid and CD44 in mouse skin : the role of TNF-α, IL-1α, and calcium ion

Abstract

[한글]

히알루론산은 세포외 기질의 중요한 성분으로 피부에서는 많은 양의 히알루론산이 진피의 결합조직에 존재하고 있다고 알려져 있으나 근래에 들어 표피에도 상당량의 히알루론산이 각질형성세포사이의 기질에 존재하고 있음이 밝혀졌다. 히알루론산은 주요 세포표면수용체인 CD44에 결합하여 세포내 신호전달을 유발하고 다양한 생화학적 효과를 나타내며 표피에서의 히알루론산과 CD44의 상호작용은 각질형성세포의 분화와 콜레스테롤 합성의 증가, 층판소체의 형성과 분비를 조절함으로써 표피투과장벽의 항상성을 유지하는데 기여한다.히알루론산은 급성 장벽 손상시에 표피에서 그 발현이 증가되며 손상을 받은 표피에서는 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase, HAS)2와 CD44가 동시간대에 기저층과 과립층에서 증가하는 것이 보고되었다. 이는 상처치유과정에서 분비가 증가하는 표피성장인자, 각질형성세포 성장인자, IL-1α, IFN- 등의 성장 인자와 싸이토카인이 히알루론산 합성효소의 발현을 증가시켜 히알루론산의 합성을 증가시킨다고 생각된다.그러나 최근 연구에 의하면 화학박피술에 사용되는 글리콜산(glycolic acid)의 국소 도포시 표피와 진피 모두에서 히알루론산의 증가가 보고되었는데, 그 작용기전은 정확히 알려져 있지 않으나 글리콜산은 피부장벽 기능의 손상 없이도 칼슘 이온의 변화와 층판 소체의 분비 촉진을 유발하며 싸이토카인의 변화를 초래할 수 있음이 몇몇 연구에서 보고된 바 있어 이는 히알루론산의 증가가 피부장벽손상이 아닌 다른 기전을 통해 이루어질 수도 있을 것이라는 의구심을 가지게 한다. 최근 초음파 영동법이 피부 장벽에 미치는 영향이 글리콜산과 같은 기전, 즉 피부 장벽 기능의 손상 없이 칼슘 이온 변화와 싸이토카인의 변화, 층판 소체의 분비를 유도하여 피부 장벽 회복 기전을 유발함이 보고되고 있어 본 연구에서는 표피장벽 기능의 손상 없이 초음파 영동법을 실시하였을 때 tape stripping을 이용하여 표피 손상을 유발한 경우와 마찬가지로 표피 히알루론산과 CD44의 발현이 증가하는지를 알아보고 히알루론산 합성의 조절 기전을 알아보고자 하였다. 초음파 영동법을 무모쥐에 실시한 뒤 6시간 후 표피 히알루론산과 HAS3, CD44의 발현은 모두 정상대조군에 비해 증가된 양상을 보였으며 이는 tape stripping으로 표피 손상을 일으킨 경우와 유사하였다. 또한 초음파 영동법 시행시 분비가 증가하는 대표적인 싸이토카인인 TNF- , IL-1 가 히알루론산과 CD44의 발현의 기전과 연관이 있는지를 알아보기 위하여 수용성 TNF 수용체 융합 단백과 IL-1 수용체 길항제를 사용하여 각 싸이토카인을 억제한 후 초음파 영동법을 시행한 결과 히알루론산과 HAS3, CD44의 발현이 모두 전처치 없이 초음파 영동법만 시행한 군에 비해 의미있게 억제된 양상을 보였다. TNF- 또는 IL-1 의 증가가 초음파 영동법에 의한 표피 히알루론산과 CD44의 발현에 관여하는지를 직접적으로 증명하기 위하여 무모쥐에 TNF- 또는 IL-1 를 다양한 농도로 직접 주입하고 6시간 후에 히알루론산과 HAS3, CD44의 발현이 각 싸이토카인의 투여 용량에 의존적으로 증가하는 양상을 보였다. 그리고 초음파 영동법에 의한 표피내 칼슘이온 기울기의 변화가 히알루론산과 CD44의 발현의 기전과 연관이 있는지를 알아보기 위하여 1.5mM의 칼슘을 포함한 젤과 칼슘이 전혀 포함되지 않은 젤을 각각 도포하고 초음파 영동법을 시행하여 본 결과 1.5mM의 칼슘을 포함한 젤을 사용하여 초음파 영동법을 시행한 군에서는 초음파 영동법시에 관찰되는 칼슘 이온 기울기의 변화가 억제되는 양상이 관찰되었으며 히알루론산과 HAS3, CD44의 발현이 의미있는 감소를 보였다. 결론적으로 급성 장벽의 손상이 없이도 초음파 영동법에 의해서 표피에 히알루론산과 그 수용체인 CD44의 발현이 증가됨을 확인하였고, 그 기전으로 초음파 영동법에 의한 표피의 칼슘 이온 기울기의 변화와 이에 의한 TNF- 와 IL-1 의 증가가 HAS3의 발현을 증가시켜 표피의 히알루론산의 합성을 증가시키며 또한 그 수용체인 CD44 발현의 증가에도 관여한다고 추정해 볼 수 있다.

[영문]Hyaluronic acid (HA) is a major extracellular matrix component in the epidermis that plays a role in cellular migration, proliferation and differentiation through it’s major cell surface receptor, CD44. HA has been demonstrated to be accumulated in the epidermis by permeability barrier disruption. Previously we demonstrated that sonophoresis can modulate the epidermal calcium gradient and stimulate epidermal cytokine expressions. We performed this study to identify whether sonophoresis could increase the expression of HA and CD44 in mouse epidermis without barrier disruption and to uncover the mechanisms involved in the upregulation of HA and CD44 expression following sonophoresis. Sonophoresis without transepidermal water loss change significantly increased the HA expression in mouse epidermis at 6 h after sonophoresis compared to untreated skin as well as in tape-stripped skin used as a positive control. The increased expression of HA was temporally and locally associated with increased expression of hyaluronic acid synthase (HAS)3 and CD44. To test whether TNF-α and IL-1α may have a functional role in sonophoresis-induced increase of HA and CD44, we used TNF-α and IL-1 specific inhibitors and the expression of HA, HAS3, and CD44 showed significant inhibition at 6 h after sonophoresis in each cytokine inhibitor pretreated skin compared to the skin without pretreatment. To determine whether the epidermal calcium gradient changes may involve in the upregulation of HA and CD44 following sonophoresis, we compared HA, HAS3, and CD44 expression in epidermis treated with sonophoresis of Ca2+-free gel vs. Ca2+-containing gel. Ion capture cytochemistry revealed that sonophoresis of Ca2+-containing gel prevented the epidermal calcium gradient change by excess calcium at all levels of the epidermis. The expression of HA, HAS3, and CD44 mRNA and immunohistochemical protein staining decreased in the epidermis after sonophoresis of Ca2+-containing gel vs. Ca2+-free gel, suggesting that the change in calcium ion can stimulate the expression of HA, HAS3, and CD44 in epidermis. To determine whether the upregulation of HA and CD44 is stimulated by TNF-α and IL-1α directly, three different concentrations of TNF-α (50ng, 100ng, 300ng in 0.1ml PBS) or IL-1α (50ng, 100ng, 300ng in 0.1ml PBS) were injected intradermally into the flanks of hairless mouse. The results showed a dose dependent stimulation of HA, HAS3, and CD44 expression by both cytokines. From these results we can suggest that epidermal calcium gradient change and sequentially induced TNF-α and IL-1α by sonophoresis could upregulate the HA expression through HAS3 induction and CD44 expression without barrier impairment.