VEGF, IL-8, or c-Met-specific short hairpin RNA-expressing oncolytic adenovirus elicits potent inhibition of angiogenesis and tumor growth

Abstract

[한글]

기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 신생 혈관 형성은 종양이 성장하고 전이되는데 있어 매우 중요한 역할을 한다. 신생혈관 형성이 일어나기 위해서는 여러 종류의 성장인자들이 필요한데, 현재 acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor alpha and beta (TGF-α and β), interleukin-8 (IL-8), c-MET등 여러 물질들이 보고되어 있다. 따라서 이들의 발현을 억제한다면, 불필요한 신생혈관형성에 기인하는 종양의 성장을 억제할 수 있다. siRNA는 21-25 nucleotide (nt)의 RNA로서 상보적인 염기서열을 갖는 유전자의 mRNA에 결합해서 분해를 유도한다. siRNA는 기존의 antisense나 ribozyme을 이용한 방법보다 훨씬 빠르고 효율적으로 gene의 knockdown을 일으킬 수 있기 때문에 그 이용 범위가 확대되고 있으며, 바이러스의 증식억제나 발암억제 등을 통해 각종 질병을 치료할 수 있는 새로운 형태의 치료물질로 주목 받고 있다. 현재 동물세포내로 siRNA를 도입하는 여러 가지 방법들이 보고되고 있으나, 대부분의 경우 transfection 효율이 낮고, 대상 세포에서 발현기간이 낮기 때문에, 장기간 효과적으로 siRNA를 발현시키기 위해서는 더 나은 벡터 시스템의 개발이 요구된다. 이러한 배경 하에 본 연구에서는, 신생 혈관형성 유도 인자들인 VEGF-A와 IL-8 그리고 c-Met유전자를 이용하여 이들 유전자의 발현을 선택적으로 저해할 수 있는 shRNA를 종양 세포에 대한 살상능과 특이성이 보다 개선된 Ad-ΔB7 아데노바이러스에 도입함으로써, 암세포에 대한 살상효과의 개선 여부를 검증하고자 하였다.먼저, 가장 강력한 혈관형성 유도인자인 VEGF-A특이적 shRNA를p53이 불활성화된 종양세포들에서만 선택적으로 복제가 가능하여 암세포 특이적 세포 살상 및 세포고사를 함께 유발할 수 있는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스인 Ad-ΔB7에 탑재한 Ad-ΔB7-shVEGF를 제작하고, ELISA를 통하여 복제가능 아데노바이러스에 의해 shRNA가 효과적으로 전사되어 VEGF의 발현을 억제하는지 확인하였다. 그 결과, shVEGF를 발현하는 종양선택적 복제가능 아데노바이러스가 대조군 복제불능 바이러스에 비해 50배 낮은 역가에서도 바이러스 감염 24시간 후에 VEGF의 발현이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었으며, 이와 더불어 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스의 E1A 단백질이 VEGF의 발현을 억제함을 확인함으로써 보다 나은 VEGF 발현 억제능을 관찰하였다. in vitro와 in vivo에서 시간별 VEGF 발현 억제능을 비교한 결과, 종양선택적 복제가능 아데노바이러스가 암세포 특이적 바이러스의 복제에 따라 shVEGF가 암세 포에서 장기간 효과적으로 전사되어 VEGF의 발현을 억제함을 확인하였고, U343인체 뇌암 세포주의 xenograft 모델을 이용한 항종양 실험에서도 우수한 항종양 효과를 확인하였다. 또한, 조직 면역염색을 통하여. 이러한 개선된 항종양 효과가 실제로 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 효과적인 shVEGF발현에 의한 혈관 형성 억제에 의한 결과임을 확인하였다.또한, IL-8 유전자를 이용하여shRNA 발현에 효과적인 프로모터를 선정하였다. IL-8의 발현을 선택적으로 억제하는 shRNA를 CMV 또는 human U6 프로모터에 의해 그 발현이 조절될 수 있는 두 종류의 아데노바이러스를 각각 제작하여 shRNA 발현에 유용한 프로모터를 검증한 결과, U6 프로모터가 shRNA 발현에 보다 효과적인 프로모터임을 확인하였다. 다양한 기능적 분석을 통해서 IL-8발현 억제로 인한 혈관 내피세포의 기능 저하로 항종양 효과가 크게 증가되었음을 확인할 수 있었고, 또한 IL-8의 발현 감소로 인하여 강력한 전이인자인 MMP-2발현이 억제됨으로써 전이암의 치료에에도 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.상기에서 선정된 U6프로모터를 이용하여 하나의 유전자를 발현시키는 것보다 두 개의 유전자를 발현시킬 경우 항종양 효과가 증가되는지를 c-Met유전자를 이용하여 검증하였다. c-Met은 간세포 성장인자 (HGF/SF) 특이적 리셉터로써 대부분의 암세포에서 과발현되거나 돌연변이 되어 암의 성장과 전이를 유도하는 인자로 알려져 있다. 두 종류의 효과적인 c-Met 특이적인 shRNA 를 각각 발현하는 바이러스와 두 종류의 shRNA를 하나의 바이러스 벡터에서 동시에 발현하는 바이러스 등 모두 세 종류의 바이러스를 제작하여 c-Met 발현 억제능을 검증하였다. ELISA를 수행한 결과, 각각의 shRNA를 발현하는 바이러스에 비하여 두 종류의 shRNA를 동시에 발현하는 바이러스가 보다 효과적으로 c-Met의 발현을 억제함을 확인하였으며, 이 바이러스에 의한 효과적인 c-Met 발현 감소로 VEGF의 발현이 억제되어 혈관내피세포의 기능이 저하되었으며, 세포 노화기전에 의해 세포증식 또한 억제됨을 검증하였다.결론적으로, 본 연구를 통해 종양 선택적 증식 및 살상이 가능한 Ad-ΔB7는 다양한 인체 종양 세포주에서 적은 역가의 바이러스의 감염으로 in vitro에서 뿐만 아니라 in vivo에서 shRNA를 효과적으로 전달할 수 있음을 증명하였으며, CMV 프로모터와 U6 프로모터의 비교를 통하여 U6 프로모터가 shRNA 발현에 효과적임을 확인하였고, 또한, 하나의 유전자에 대해 다른 염기서열을 가지는shRNA를 동시에 발현시킴으로써 대상 유전자의 발현 억제능을 보다 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 연구에서 제작한 신생혈관형성 유도인자 특이적 shRNA를 발현하는 아데노바이러스는 암세포 특이적 복제 및 살상을 유도할 수 있을 뿐 아니라 이들 유전자 특이적 shRNA를 암세포에서만 전사시킴으로써 종양 내 신생혈관 형성을 선택적으로 억제할 수 있으며 아데노바이러스의 복제에 따른 지속적이고 증폭된 shRNA의 전사로 신생혈관 형성 억제능이 증가되고, 이에 따라 항종양 효과가 현저하게 증진될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 아데노바이러스의 E1 단백질이 신생혈관형성을 유도하는 인자인 VEGF와 IL-8을 효과적으로 억제함으로써 상승효과를 가질 것이다. 종합적으로 결론을 내리면, 바이러스의 선택적 복제에 따른 체내에서의 안전성과 신생혈관 형성억제에 따른 증대된 바이러스의 암세포 살상능에 따른 상승효과로 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있어 바이러스를 이용한 암의 치료연구에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]RNAi, due to its target specificity may be highly effective as a novel therapeutic modality but direct delivery of synthetic siRNA still remains a major obstacle for this approach. To induce long term expression and specific gene silencing, novel delivery vector system is also required. To overcome this shortcoming, I constructed an oncolytic adenovirus (Ad)-based shRNA expression system (Ad-∆B7-shVEGF) against vascular endothelial growth factor (VEGF), a key mediator in angiogenesis. To demonstrate VEGF-specific nature of this newly engineered Ad-based shRNA, replication-incompetent Ad expressing VEGF-specific shRNA (Ad-∆E1-shVEGF) was also generated. Ad-∆E1-shVEGF was highly effective in reducing VEGF expression, and elicited anti-angiogenenic effect in vitro as well as in vivo. Similarly, Ad-ΔB7-shVEGF exhibited potent anti-angiogenic effects in the matrigel plug assay in vivo. Moreover, Ad-ΔB7-shVEGF also demonstrated enhanced antitumor effect and survival advantage compared to its cognate control oncolytic Ad, Ad-ΔB7. Tumor histological analysis revealed that Ad-ΔB7-shVEGF induced significant reduction in tumor vasculature, verifying the anti-angiogenic mechanism. Furthermore, the duration and magnitude of the gene silencing effect following infection with Ad-ΔB7-shVEGF was longer and more effective than the replication-incompetent Ad, Ad-ΔE1-shVEGF. Taken together, these results suggest that the combined effects of oncolytic viral therapy and cancer cell-specific expression of VEGF-targeted shRNA elicits greater anti-tumor effect than an oncolytic Ad alone.To select effective promoters for expression of shRNAs, I used IL-8, a potent pro-angiogenic factor. I also manufactured replication-incompetent Ads (Ad-ΔE1-CMVshIL8 and Ad-ΔE1-U6shIL8) under the control of the CMV and U6 promoters, respectively. Ad-ΔE1-U6shIL8 was highly effective in reducing IL-8 expression, and was much more effective in driving IL-8 specific shRNA than the CMV promoter-driven vector. The reduced IL-8 expression then translated into decreased angiogenesis in vitro as measured by migration, tube formation, and rat aortic ring sprouting assays. In addition to its effect on endothelial cells, Ad-∆E1-U6shIL8 also effectively suppressed the migration and invasion of cancer cells. I also have generated an efficient oncolytic adenovirus (Ad)-based shRNA expression system (Ad-∆B7-U6shIL8) against IL-8, a potent pro-angiogenic factor. In vivo, intra-tumoral injection of Ad-∆B7-U6shIL8 significantly inhibited the growth of Hep3B and A549 human tumor xenografts. Histopathological analysis of Ad-∆B7-U6shIL8-treated tumors revealed an increase in apoptotic cells and a reduction in mcro-vessel density. Finally, Ad-∆B7-U6shIL8 was also shown to inhibit the growth of disseminated MDA-MB-231 breast cancer metastases. Taken together, these findings demonstrate the utility and anti-tumor effectiveness of oncolytic Ad expressing shRNA against IL-8.To develop effective shRNA inhibition system, I compared single or dual shRNA expression system. c-Met, receptor tyrosine kinase for hepatocyte growth factor (HGF) is overexpressed and/or mutated a variety of human tumors. Since HGF-Met signaling contributes to tumor survival, growth, angiogenesis, and metastasis, various approaches have been explored to inhibit the function of HGF or Met. In this study, I generated recombinant adenovirus expressing c-Met-specific shRNA and compared single and dual shRNA expression system, too. All constructed c-Met specific shRNA-expressing Ads inhibited c-Met expression. Among these, dual shMet-expressing Ad, Ad-∆E1-shMet4+5, was more effective than single shRNA-expressing-Ads in driving c-Met specific shRNA. Cells infected with shMet-expressing Ads were showed dramatic growth inhibition and characteristic changes in morphology. That is, phenotypes such as enlarged and flattened cell morphology, increased granularity and the appearance of many vacuolated cells were typical senescence-like phenotype and mRNA level of the genes commonly associated with cellular senescence like SM22, TGase II, and PAI-I was increased. Also, it was observed that the reduced c-Met expression could inhibit cancer cell proliferation by arresting cells at G2/M phase using cell cycle analysis. Reduced c-Met expression down-regulated VEGF expression and reduced angiogenesis in vitro as measured by migration, tube formation, and rat aortic ring sprouting assays. In addition to inhibition of endothelial cell functioning, Ad-∆E1- shMet4+5 effectively suppressed the migration and invasion of cancer cells. Moreover, intra-tumoral injection of Ad-∆E1-shMet4+5 inhibited tumor growth significantly more than single shMet-specific shRNA expresiing Ad, Ad-∆E1-shMet4 or Ad-∆E1-shMet5. Histopathological analysis of tumors treated with Ad-∆E1-shMet4+5 revealed an inhibition of cancer cell proliferation and reduction in vessel density. Furthermore, treatment of Ad-∆E1-shMet4+5 inhibited the growth of disseminated MDA-MB-231 breast cancer metastases. Taken collectively, these findings demonstrate that the inhibition of c-Met function by dual c-Met specific shRNA expressing Ad suppress cancer cell proliferation via senescence mechanism and tumor growth, invasion, metastasis and angiogenesis.