K6PC-5 as a sphingosine kinase activator induces both keratinocyte differentiation and fibroblast proliferation in skin

Abstract

[한글]

스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 생리활성 스핑고지질 대사물로서 세포의 칼슘신호, 증식, 생존 및 분화와 같은 다양한 세포 반응을 조절한다. 스핑고신 키나제(SK)는 S1P를 직접적으로 만드는 효소이기 때문에 그의 활성과 S1P의 양을 조절하는 많은 인자들이 확인되었다. 본 연구에서는 새로이 합성된 SK 활성화제인 K6PC-5가 각 세포 내 칼슘신호를 통해서 피부에서 각질형성세포의 분화 및 섬유아세포의 증식을 모두 유도함을 증명하였다. 친유성 화합물이며, 화학명이 N-(1,3-dihydroxyisopropyl)-2-hexyl-3-oxo-decanamide인 K6PC-5는 먼저 HaCaT 각질형성세포 및 사람의 피부 섬유아세포에서 세포 내 칼슘 농도의 파동을 야기함을 확인하였다. SK 억제제인 디메칠스핑고신 및 디히드로스핑고신과 siRNA-SK1은 K6PC-5가 유도하는 세포 내 칼슘증가를 억제하였다. K6PC-5에 의해 야기되는 칼슘 파동은 탑시가르진에 민감한 칼슘 저장고를 이용하였다. 또한, K6PC-5에 의한 칼슘증가는 1,4,5-이노시톨 포스페이트 경로에는 비의존적임을 확인하였다. 이러한 K6PC-5의 세포 내 칼슘 반응은 각질형성세포 및 섬유아세포에서 모두 동일하였다. 다음으로 HaCaT 각질형성세포와 표피 과증식 마우스 모델을 이용하여 K6PC-5가 각질형성세포의 분화에 미치는 영향을 평가하였다. K6PC-5는 HaCaT 세포에서 분화 관련 표지 단백질인 인보루크린 및 필라그린의 발현을 증가시켰다. 그러나, siRNA-SK1 는 K6PC-5에 의한 인보루크린의 증가를 억제하였다. K6PC-5를 피부에 도포한 경우에도 인보루크린, 로리크린, 필라그린, 케라틴5의 발현을 증가시켰고, 또한, 마우스의 표피에서 칼슘의 이동을 유도하였다. K6PC-5는 반복된 테이프 스트리핑에 의해 유도된 표피 과증식을 억제하였다. 즉, 표피 두께 및 PCNA로 염색되는 각질형성세포의 증가를 억제하였다. 이러한 결과들은 K6PC-5가 세포 내 S1P 생성을 통해 세포 내 칼슘 반응을 유도하여 각질형성세포의 분화 및 증식을 동시에 조절함을 제안한다. 끝으로 사람의 피부 섬유아세포와 내인성 노화 마우스 모델을 이용하여 K6PC-5가 섬유아세포의 증식에 미치는 영향을 평가하였다. K6PC-5는 먼저 섬유아세포의 증식과 콜라겐 생성을 농도 의존적으로 촉진하였다. K6PC-5를 내인성 노화를 유도한 무모 생쥐(56주령)의 등부에 2주간 도포하였을 때, 진피에서 섬유아세포의 증식과 콜란겐 생성을 촉진하였고, 그 결과 진피의 두께도 유의하게 증가시켰다. K6PC-5는 또한 표피 분화 단백질인 인보루크린, 로리크린, 필라그린, 케라틴5을 증가시켰고, 표피 장벽 기능의 이상을 유도하지 않았다. 이러한 결과들은 K6PC-5가 S1P 생성을 통해 세포 내 칼슘 반응을 유도하여 섬유아세포의 증식을 조절하고, 더 나아가 각질형성세포의 분화를 촉진함을 제안한다. 따라서, 이상의 연구 결과로부터 K6PC-5는 SK1 활성화에 의한 직접적인 S1P 생성을 통해 표피 및 진피에 역설적인 효과를 유도함을 밝혔고, 또한, S1P의 조절은 아토피 피부염, 건선, 피부 노화 등의 피부질환 치료를 위해 새로운 접근법임을 제안한다.

[영문]Sphingosine-1-phosphate (S1P), a bioactive sphingolipid metabolite, regulates multiple cellular responses such as Ca2+ signaling, growth, survival and differentiation. Because sphingosine kinase (SK) is the enzyme directly responsible for the production of S1P, many factors have been identified that regulate its activity and subsequent S1P levels. In this study, it was demonstrated that a newly-synthesized SK activator, K6PC-5, induces both keratinocyte differentiation and fibroblast proliferation in skin through intracellular Ca2+ signaling in keratinocytes and fibroblasts. K6PC-5, a hydrophobic compound chemically named N-(1,3-dihydroxyisopropyl)-2-hexyl-3-oxo-decanamide, induced intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) oscillations in HaCaT cells and human fibroblasts. Both dimethylsphingosine (DMS) and dihydroxysphingosine (DHS), SK inhibitors, and transfection of small interfering RNA for SK1 (SK1-siRNA) blocked the K6PC-5-induced [Ca2+]i increases. The K6PC-5-induced [Ca2+]i oscillations were dependent on thapsigargin-sensitive Ca2+ stores and Ca2+ entry, but independent of classical phospholipase C-mediated pathway. The Ca2+ responses of K6PC-5 in both keratinocytes and fibroblasts showed the same results. Next, to study the effect of K6PC-5 on keratinocyte differentiation, HaCaT keratinocytes in vitro and hyperproliferative murine model in vivo were used. K6PC-5 enhanced the expression of involucrin and filaggrin, specific differentiation-associated marker proteins in HaCaT cells, while transfection of siRNA-SK1 blocked the increase of involucrin. Topical K6PC-5 also enhanced the expression of involucrin, loricrin, filaggrin, and keratin 5, and induced Ca2+ mobilization, in intact murine epidermis. K6PC-5 inhibited epidermal hyperplasia induced by repeated tape stripping. The increase of both epidermal thickness and PCNA-positive keratinocytes was inhibited by topical K6PC-5. These results suggest that K6PC-5 acts to regulate both differentiation and proliferation of keratinocytes via [Ca2+]i responses through S1P production. Finally, to study the effect of K6PC-5 on fibroblast proliferation, human neonatal fibroblasts in vitro and intrinsically-aged murine model in vivo were used. K6PC-5 promoted fibroblast proliferation and procollagen production in a dose-dependent manner in human fibroblasts. Topical application of K6PC-5 for 2 weeks to intrinsically-aged hairless mice (56 weeks old) enhanced fibroblast proliferation, collagen production, and eventually increased dermal thickness. K6PC-5 also promoted specific epidermal differentiation marker proteins, including involucrin, loricrin, filaggrin, and keratin 5, without any alterations in epidermal barrier function. These results suggest that K6PC-5 acts to regulate fibroblast proliferation via [Ca2+]i responses through intracellular S1P production, and can further promote keratinocyte differentiation. Thus, these results reveal that K6PC-5 induces paradoxical effects on the epidermis and dermis through SK1-mediated S1P production, and suggest that S1P regulation may represent a novel approach for the treatment of skin disorders such as atopic dermatitis, psoriasis, and skin aging.