Regulatory function of agmatine in neuroinflammation following cerebral ischemia

Abstract

[한글]

염증반응은 중추신경계질환의 가장 큰 특징이며, 이는 아교세포의 활성화와 연관되어 있다. 미세아교세포는 중추신경계에 존재하는 면역반응세포로서, 뇌손상에 의해 활성화된 후 종양괴사인자-α (TNF-α), 인터루킨-1β (IL-1β)과 같은 전염증성 사이토카인과 일산화질소 (NO)를 포함하는 신경독성물질을 분비한다. 또한, 활성화된 아교세포는 염증반응과정의 중요한 구성요소가 된다.아그마틴은 알기닌탈탄소효소에 의해 생성되는 필수아미노산이며, 아그마틴은 NOS의 길항제로서 일산화질소의 생성에 대한 내재성 조절체로 작용함이 보고된 바 있다. 생쥐에게 실험적인 뇌허혈 손상을 일으킨 후 아그마틴을 복강 내 주사하였을 때 신경보호작용에 대한 기전이 보고된 바 있다. 본 연구에서는 뇌허혈의 실험실모델인 중간대뇌동맥결찰술을 이용한 뇌허혈 동물모델과 LPS로 유도된 신경염증손상 모델에서 종양괴사인자-α, 인터루킨-1β와 같은 전염증성 사이토카인과 일산화질소의 생성에 미치는 아그마틴의 작용을 검토하였다. 대뇌허혈로 인해 생산되는 사이토카인의 분비에 대한 아그마틴의 역할을 규명하기 위해, BV2 미세아교세포주를 배양한 후 혐기성 챔버로 옮기고, 산소와 글루코스 결핍과 동시에 100 μM의 아그마틴을 처리하였다. 또한, 배양된 미세아교세포주를 1 ㎍/㎖ 의 lipopolysaccharide (LPS)로 염증반응을 일으킨 후, 100 μM의 아그마틴을 처리하였다. 그리고, 수컷 백서에 90분 동안 중간대뇌동맥결찰술을 시행함과 동시에 100 ㎎/㎏의 아그마틴을 복강 내 주사하거나, 재관류가 시작될 때 동량의 아그마틴을 주사하였다.아그마틴은 산소와 글루코스결핍에 의한 미세아교세포의 손상과 LPS로 유도된 염증성 손상시 세포사멸을 감소시켰다. 이러한 세포보호효과는 아그마틴이 NOS의 활성, 발현 뿐 아니라 일산화질소의 생성과 연관되어 있다고 보고된 바 있으므로, 본 연구에서도 뇌허혈 손상과 신경염증 손상 후 아그마틴에 의한 신경보호작용이 NO의 생성과 이를 생성하는 iNOS 효소의 발현과 어떠한 연관성이 있는 지 조사하였다. 본 연구에서 중간대뇌동맥결찰 후 동측 대뇌피질과 선조체에서, inducible nitric oxide synthase (iNOS) 양성반응세포의 수가 증가하였고, iNOS 면역양성반응은 미세아교세포 뿐 아니라 별아교세포에서도 확인되었다. 그리고, 중간대뇌동맥결찰술과 LPS로 유도된 염증성 손상 시 발현되는 iNOS 양성반응세포의 수가 아그마틴에 의해 감소함을 확인하였다. 또한, 종양괴사인자-α, 인터루킨-1β와 같은 전염증성 사이토카인과 iNOS, nuclear factor-kB (NF-kB)항체를 이용하여 면역조직화학과 Western blot 분석을 시행하였다. 중간대뇌동맥결찰술과 LPS로 유도된 염증성 손상 후 동측 대뇌 피질과 선조체에서 종양괴사인자-α와, 인터루킨-1β 면역양성반응세포의 수가 각각 증가하였으며, 아그마틴에 의해 그 수가 유의하게 감소하였고, NF-κB 면역양성반응세포 수 또한 아그마틴에 의해 감소하였다. 아그마틴은 미세아교세포의 활성을 억제시키며, 아그마틴을 주사한 군에서는 미세아교세포에서 종양괴사인자-α와, 인터루킨-1β, iNOS, NF-kB 항체에 대한 면역반응활성이 유의하게 감소하였으나 활성화된 별아교세포 수의 변화에는 유의성이 없었다.이상과 같은 결과는 중간대뇌동맥결찰술이나 LPS로 유도된 염증성 손상 후 미세아교세포에서 아그마틴이 iNOS의 발현을 억제함으로써 일산화질소의 생성을 감소시키고, 핵 안으로의 NF-κB translocation을 감소시킴으로써 종양괴사인자-α, 인터루킨-1β의 발현이 감소함을 나타낸다. 이상의 결과로부터 아그마틴이 미세아교세포의 활성과 NF-κB 조절을 통해 일산화질소의 생성을 억제하는 항염증효과가 있을 것으로 생각된다.

[영문]Inflammation is a hall mark of various central nervous system (CNS) diseases and this is linked to glial activation. Microglia is the resident immune cells of CNS and is activated in response to brain injury and release neurotoxic factors including nitric oxide (NO) and proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β). Also, reactive gliosis is a component of an inflammatory process. It has been reported that agmatine given intraperitoneally to mice reduce the infarct area of brain from ischemic injury and possible neuroprotective mechanism. In this study, the role of agmatine on TNF-α, IL-1β, NO production in in vitro ischemia like injury model and in middle cerebral artery occlusion (MCAO) animal model were evaluated. To address the effect of agmatine on release of cytokines in cerebral ischemia, BV2 microglial cells were transferred into an anaerobic chamber and treated with agmatine (100 μM) at the start of oxygen glucose deprivation (OGD) or lipopolysaccharide (LPS) (1 ㎍/㎖) treatment. MCAO was performed in male Sprague-Dawley (SD) rat for 90 minutes and agmatine (100 mg/kg) was administered by IP injection at the begining of and at the end of occlusion respectively. Agmatine treatment reduced cell death in microglial cells after OGD and LPS induced injury. It has been reported that this protection by agmatine is associated with decreased NOS activity and expression, as well as NO generation. Agmatine decreased the number of iNOS positive cells in MCAO and LPS induced injury model. iNOS immunoreactivity was also expressed in microglial cells and astrocytes, and the number of iNOS positive cells were increased in ipsilateral cerebral cortex and striatum after 24 hours from MCAO injury respectively.Immunohistochemistry and Western blot analysis were also performed using antibodies of proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and nuclear factor-kB (NF-kB). The number of TNF-α and IL-1β positive cells were increased in ipsilateral cerebral cortex and striatum after MCAO or LPS injury, respectively, and agmatine treatment decreased the number of each cytokine immunopositive cells significantly. The number of NF-κB positive cells was also reduced in cerebral cortex and striatum after MCAO or LPS injection by agmatine treatment. Agmatine suppresses microglial activation, and the immunoreactivity for TNF-α, IL-1β, iNOS, NF-kB were predominantly reduced in agmatine treated group compared with non-treated group in microglia, but not in reactive astrocytes. This results show that agmatine suppressed the production of NO via inhibiting iNOS expression in microglia and reduced the expression of TNF-α and IL-1β through NF-κB translocation into nucleus during MCAO or LPS induced inflammatory injury. Thus, agmatine is suggested to have anti-inflammatory effect with suppression of microglial activation and NO production through regulation of NF-κB.