The effects of retinoic acid on the activation of Smad induced by transforming growth factor-β1

Abstract

[한글]

특발성폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 알려지지 않은 원인에 의해 폐에 섬유모세포가 증식하면서 섬유화가 진행되어, 대개 진단 후 3년 이내에 사망하는 치명적인 폐질환이나 아직 효과적인 치료 약제가 없는 실정이다. 최근 IPF의 병리 기전으로 형질전환성장인자-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)에 의해 조직 복구가 과도하게 일어나면서 세포외 기질 침착 및 폐조직 파괴가 유발되어 나타나는 것으로 알려져 있다. TGF-β는 세포막의 serine/threonine kinase 수용체에 결합하여 세포질 내의 Smad2 및 Smad3 단백질을 인산화 시키고, 세포핵 내로 이동하여 표적 유전자(target gene)를 활성화한다. 레티노익산(retinoic acid, RA)은 비타민 A의 유도체로 세포의 분화, 증식, 발생, 성장 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 여러 인자의 활성화 또는 억제와 관련이 있다. 본 연구는 레티노익산이 TGF-β1에 의해 유발된 Smad 활성화에 미치는 영향을 관찰함으로써 향후 레티노익산이 특발성폐섬유증의 치료제로서 가능성에 있는 지에 대해 알아보고자 하였다.IPF로 확진된 28예 환자들의 폐조직에서 면역조직화학염색을 통하여 TGF-β1의 중요한 신호전달 물질인 II형 수용체(TβRII)와 인산화-Smad2/3 (p-Smad2/3)의 발현이 증가되어 있음을 알 수 있었다. A549 세포에 대하여 배양 배지만 투여된 대조군, TGF-β1만 투여된 경우, 세 가지 RA (ATRA, 9-cis RA 및 13-cis RA)가 각각 투여된 경우, TGF-β1과 RA 두 가지 모두 투여된 경우 각각에 대해 western blot을 시행하였다. 1.0 ng/mL의 TGF-β1이 투여된 지 15분 후에 Smad2, 3이 증가되면서 인산화 Smad2/3도 함께 증가된 양상을 보였고, 자극 1시간 후에 Smad2/3 인산화가 가장 증가하였고, 6시간 이후에는 점차 감소하였다. Smad1, 4, 5는 변화가 없었고, 억제성 Smad인 Smad7은 약간 감소하였다. ATRA, 9-cis RA 및 13-cis RA가 각각 투여된 경우 그 농도와 관계없이 RA는 Smad2, 3, 4 단백질에 영향을 주지 않았다. TGF-β1으로 먼저 자극한 이후에 RA를 투여한 경우에는 Smad1, 2, 3, 4, 5, 7의 큰 변화 없이 Smad2/3의 인산화를 RA가 완전히 억제하는 것이 관찰되었다. 그러나 RA를 전처치한 후 TGF-β1을 나중에 투여한 경우에는 Smad2/3 인산화가 RA에 의해 억제되지 않는 것이 관찰되었다. 두 약물의 투여 간격을 1시간에서 30분 및 24시간으로 변화를 주어 실험하였으나, 투여 간격과 상관없이 Smad2/3 인산화가 RA에 의해 억제되지 않았다. 이러한 이유는 RA로 전처치된 세포는 오히려 TβRII에 더 예민하게 반응하여 TGF-β1의 자극에 대해 Smad2/3의 인산화를 더 증가시킬 수도 있는 것으로 추론되었다.이상의 결과를 종합하여 볼 때 RA와 TGF-β1의 상호작용은 다양한 기전을 통해 Smad 인산화의 변화를 가져오며, TGF-β1이 활성화되어 있는 상태에서 RA가 Smad2/3의 인산화를 효과적으로 억제하므로 TGF-β1이 활성화되어 있는 특발성페섬유증 환자의 치료제로서 RA가 유용할 것으로 판단된다.

[영문]Idiopathic pulmonary fibrosis(IPF) is a chronic progressive fibrotic interstitial lung disease associated with fibroblast proliferation due to unknown etiology. Increasing number of recent studies investigate the role of TGF-β1 for the pathogenesis and treatment of IPF. TGF-β regulates the cell proliferation, differentiation, apoptosis, embryonic development, wound healing, and angiogenesis through phosphorylation of Smad protein. Retinoic acids(RAs), active vitamin A derivatives, also play a critical role in cell differentiation, proliferation, and apoptosis. The relationship between RA and TGF-β1 signal pathway is recently being investigated with role of lung fibrosis. This study was investigated to find out whether TGF-β1 signal pathway was activated in the lung tissues from IPF patients and RA inhibited phosphorylation of Smad 2/3 induced by TGF-β1. It may provide a new experimental basis for RA treatment in IPF patients.Immunohistochemical staining of lung tissues from 28 patients with IPF showed that expression of phosphorylated-Smad2/3(p-Smad2/3) and type II TGF-β1 receptor(TβRII), major signaling molecules acting downstream of TGF-β1 signal pathway, were increased. A549 cells were incubated for 24 hours and then the reactive proteins were electrophoresed on a 10% SDS-PAGE gel after stimulated with three different retinoic acids, TGF-β1, and TGF-β1 in combination with RA, respectively. The levels of Smad proteins and p-Smad2/3 were analyzed by immunoblotting. TGF-β1 increased the phosphorylation of Smad2/3. When A549 cells were pre-stimulated with TGF-β1 prior to RA treatment, RA completely inhibited the phosphorylation of Smad2/3 induced by TGF-β1. However, A549 cells were pre-treated with RA prior to TGF-β1 stimulation, RA could not suppress the phosphorylation of Smad2/3 induced by TGF-β1. These different results might be induced by interactions between TGF-β1 and RA which provide a variety of mechanisms through subtle alterations in Smad protein. In conclusion, RA had inhibitory effects on the activation of Smad induced by pre-stimulated TGF-β1. RA may be a new therapeutic agent for the treatment of IPF patients who have activated and over-stimulated TGF-β1 pathway.