Identification of differentially expressed genes (DEGs) under the proliferation and differentiation conditions of human neural stem cells (NSCs) using annealing control primers (ACPs)

Abstract

[한글]

인간 신경줄기세포를 배양하기 위하여 재태연령 13주에 자연 유산되어 사망한 태아 사체의 종뇌 (telencephalon) 조직에서 증식능력을 보이는 단일 신경세포들을 분리하여 생체 외에서 장기간 신경구 (neurospheres)상태로 배양하였는데, 본 세포들은 신경줄기세포, 신경전구세포 (neural progenitors), 방사교세포 (radial glial cells), 신경원 전구세포 (neuronal progenitor) 및 신경교 전구세포 (glial progenitor) 등 다양한 종류의 세포형태로 구성되어 있으며, 특이적인 성장, 증식, 분화 및 지역 특이 유전자 발현 형태를 보였다.신경구 형태로 배양되는 미성숙 인간 신경줄기세포 혹은 전구세포의 증식 및 분화관련 유전자를 확인하기 위하여 본 연구에서는 결합조절 프라이머(ACPs)를 이용한 정확하고 새로운 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)기술을 사용하였는데, 인간 신경줄기세포의 증식 및 분화 조건에서 특이적으로 차별 발현되는 유전자들(DEGs)을 확인하였고, 본 DEGs들의 정확성 및 정량성은 정량적 중합효소연쇄반응과 실시간 효소연쇄반응 방법을 통해서 검증하였다.110개의 ACPs를 사용하여 증식 및 분화조건의 인간 신경줄기세포에서 추출한 RNAs를 RT-PCR로 분석한 결과 약 500개의 반응물 (amplicons)을 얻었고, 이 반응물들 중에서 34개의 DEGs를 찾았으며, 염기서열을 분석하고 확인한 결과 4개의 amplicons은 증식상태에서 높게 발현되었고 30개의 amplicons은 분화상태에서 높게 발현됨을 확인하였다. 확인된 34개의 DEGs 연기서열과 유사성을 가진 유전자 부분을 찾기 위하여 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)를 사용하였는데, 증식상태에서 높게 발현되는 4개의 DEGs 중 2개는 알려진 유전자이고 2개는 알려지지 않은 유전자였으며, 분화상태에서 높게 발현되는 30개의 DEGs 중 25개는 알려진 유전자였고 5개는 알려지지 않은 유전자로 확인되었다. 따라서 본 연구결과는 유전자 차원에서 인간 신경줄기세포의 증식과 분화에 관련된 분자학적 기전을 이해하는데 사용될 수 있으며, 관련 유전자의 생물학적 기능 연구에도 도움을 줄 수 있다.

[영문]Proliferating single cells were isolated from the telencephalic brain region of human fetal cadavers at 13 weeks of gestation and grown as neurospheres in long-term cultures. Human neurospheres derived from the telencephalon were found to contain cells of different subtypes, suggesting that multipotent neural stem cells (NSCs), progenitors, or radial glial cells co-exist with restricted neuronal or glial progenitors within the spheres. These cells also had specific regional and temporal characteristics with regard to their growth, differentiation, and region-specific gene expression.In order to identify genes that are involved under the proliferation and differentiation conditions of human neural stem cells (NSCs), we employed a new and accurate reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique using annealing control primers (ACPs). This method could detect differentially expressed genes (DEGs) that were expressed specifically or prominently under the proliferation and differentiation conditions of human NSCs in culture. RT-PCR and/or real time PCR were used to validate these DEGs.Using 110 ACPs, the RT-PCR analysis of human NSCs resulted in approximately 500 amplicons. Among them, we identified and sequenced 34 amplicons of DEGs; 4 amplicons were highly expressed under the proliferation condition and 30 amplicons were highly expressed under the differentiation condition of human NSCs. To find regions of local similarity between these DEG sequences, we used the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). The results showed that the expression of 2 known and 2 unknown genes were highly increased under the proliferation condition and the expression of 25 known and 5 unknown genes were highly increased under the differentiation condition of human NSCs. These data would provide some insights into the genetic mechanisms involving molecular events and biological functions in the proliferation and differentiation of human NSCs.