Effect of epigallocatechin-3-gallate on intimal hyperplasia after vascular grafting

Abstract

[한글]목적 혈관내막과다증식은 혈관우회술 혹은 중재술 후 재협착의 주요한 원인으로, 혈관손상 후 중간막에 존재하는 혈관평활근세포가 내막으로 이동하며 과다증식하여, 세포외결체조직과 함께 축적되어 형성된다. 녹차추출물의 주요 성분 중 하나인 epigallocatechin-3-gallate (EGCG)는 혈관평활근세포의 이동 및 증식을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 EGCG가 혈관평활근세포의 활동을 억제함으로써 내막과다증식을 억제하는 효과가 있을 것으로 기대된다. 본 연구는 EGCG가 혈관수술 후 내막증식에 미치는 영향을 알아보기 위한 것이다.방법 인간제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)와 쥐의 대동맥평활근세포(rat aortic smooth muscle cell, RASMC)를 in vitro 환경에서 배양하고, 세포배양액에 EGCG(0 - 400 μM)를 첨가하였다. 3일간 세포배양 후 세포활성도을 측정하여 EGCG 농도에 따른 세포증식 억제효과를 비교하였다. 세포이동 측정을 위해서는 내피세포와 평활근세포가 단일층으로 배양된 배지에 세포가 없는 구역을 만들고 현미경관찰하에 세포배양하며 임의로 선택한 세포가 이동하는 것을 추적하여 세포의 이동 속도를 측정하였다. 내막증식에 미치는 효과를 확인하기 위해 개를 이용한 동물실험을 시행하였다. 20마리의 개의 양측 경동맥에 자가경정맥을 이식하였으며, 채취한 경정맥을 대조군(n=10)은 생리식염수에, EGCG군(n=10)에서는 EGCG를 포함하는 생리식염수에 30분 동안 담근 뒤 이식하였으며, EGCG군은 100 mM의 EGCG를 이식혈관주위에 도포하였다. 이식 후 30일 후에 경정맥이식편을 회수하여 내막과 중간막의 두께를 측정하였다.결과 혈관내피세포의 증식은 EGCG의 농도가 100 μM 이상에서, 혈관평활근세포의 증식은 400 μM 이상 농도에서 대조군에 비해 억제되었다 (p < 0.05). 200 μM의 EGCG가 첨가된 세포배지에서 혈관평활근세포의 이동성은 대조군에 비해 억제되었으나 (control 38.8 μm/hour vs EGCG group 24.3 μm/hour, p < 0.05), 내피세포의 이동성은 영향을 받지 않았다 (control 36.9 μm/hour vs EGCG group 34.4 μm/hour). 동물실험 결과 회수한 정맥도관의 내막에 다양한 정도의 내막과다증식이 관찰되었으며, 대조군에서 EGCG군에 비해 내막의 두께가 두꺼웠으나 (95 ± 43 vs 47 ± 37 μm, p < 0.05), 중간막의 두께는 두 군간에 차이가 없었고 (247 ± 95 vs 267 ± 224 μm, p = 0.67), 내막/중간막의 두께비는 EGCG군에서 낮게 관찰되었다 (0.41 ± 0.17 vs 0.21 ± 0.15, p < 0.05).결론 EGCG는 혈관우회술 후 혈관내막과다증식을 억제하는 효과가 있으며, 이는 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 억제하여 효과를 나타낸다고 생각된다. 따라서 EGCG는 혈관이식술 및 중재술 후 발생하는 혈관내막과다증식의 억제에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]Background: Intimal hyperplasia is a major cause of stenosis after vascular grafting and intervention, and is characterized by proliferation and migration of medial smooth muscle cells with an associated deposition of extracellular connective tissue matrix in the intimal layer. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), the major constituent of green tea, is known to suppress the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (SMCs). We propose that EGCG may have a protective effect against the development of intimal hyperplasia through the suppression of vascular SMC behavior. The purpose of this study is to evaluate the effect of EGCG on the prevention of intimal hyperplasia after vascular graftingMaterials and Method: Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and rat aortic smooth muscle cells (RASMC) were cultured in vitro and EGCG was added to the culture media (0 - 400 μM). After culturing for 3 days, cell proliferation was measured and the dose-dependent suppressive effects were studied. For the cell migration assay, cell migration speed was measured by tracing randomly selected cells under the microscope after forming a denuded area in a single layer of cells in culture media. To evaluate the effect of EGCG on intimal hyperplasia, we performed in vivo experiments using a canine model. We interposed an autologous jugular vein graft into the bilateral carotid arteries in 20 dogs. The vein graft was stored for 30 minutes in normal saline (control group, n=10) or EGCG solution (EGCG group, n=10) before grafting. For the EGCG group, 100 mM of EGCG was applied in the perivascular space. After 30 days, the vein graft was retrieved and thickness of the intima and media was measured.Results: The proliferation of RASMCs and HUVECs was suppressed by the addition of EGCG to the media (concentration of 400 and 100 μM, respectively, p < 0.05). The migration of RASMCs was suppressed with 200 μM of EGCG (control 38.8 μm/hour vs. EGCG group 24.3 μm/hour, p < 0.05), however the migration of HUVECs was not affected by EGCG treatment (control 36.9 μm/hour vs. EGCG group 34.4 μm/hour). In the in vivo study, the intimal thickness of the retrieved vein graft was thicker in control group than in the EGCG group (95 ± 43 vs. 47 ± 37 μm, respectively, p < 0.05), however there was no difference in medial thickness between the groups (247 ± 95 vs. 267 ± 224 μm, respectively, p = 0.67). The intima/media thickness ratio was lower in the EGCG group than in the control group (0.41 ± 0.17 vs. 0.21 ± 0.15, respectively, p < 0.05).Conclusion: EGCG can suppress intimal hyperplasia after vascular grafting through the inhibition of the vascular SMC migration and proliferation. Treatment of EGCG may offer new intra-operative therapeutic modalities to reduce the development of intimal hyperplasia.