Dexamethasone increases fluid absorption through Na+/H+ exchanger 3 activation in normal human middle ear epithelial cells

Abstract

[한글]배경: 중이 점막을 덮고있는 점액의 적절한 조절 및 유지는 중이 점막 상피세포의 중요한 기능의 하나이며 중이강을 삼출액이 없도록 유지해 주는데 매우 중요하다. 이러한 항상성의 장애는 중이강 내의 삼출액 저류로 이어지고 결과적으로 중이염을 일으킨다.목적: 본 논문의 목적은 먼저 Na+/H+ exchanger (NHE)가 사람 정상 중이점막 상피세포에서 발현되는지 여부와 이 이온 채널이 사람 정상 중이점막 상피세포에서 발현된다면 기능적으로 활성화되어 있는지 증명하는 것 이며 또한 중요한 이비인후과 질환의 하나인 삼출성 중이염에서 발병과 치료에 중요한 역할을 할 것으로 생각 되는 세포의 삼출액 흡수에 있어서 Na+/H+ exchanger가 어떤 역할을 하는지 증명 하고 마지막으로 사람 정상 중이점막 세포에서 Na+/H+ exchanger에 의존하는 삼출액 흡수와 Na+/H+ exchanger의 기능에 대한 dexamethasone의 효과를 증명하는 것 이다.재료 및 방법: NHE1,2,3가 사람 정상 중이점막 상피세포에서 발현되는 것을 증명하기 위해 Western blot analysis를 사용하였다. 사람 정상 중이점막 세포의 용액 흡수 속도는 세포의 표면에 용액을 도포한 후에 세포 표면에 남아있는 용액의 BD의 농도를 측정 하여 흡수된 용액의 양을 측정 함으로서 속도를 측정하였다. 세포 내 pH는 형광 물질인 bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF)-AM를 이용해 측정하였다. Na+/H+ exchanger의 활성도 는 세포에 40 mmol/l NH4Cl을 주었을 때 가해진 세포 내 산성화로부터 Na+ 을 주었을 때 발생하는 pH 회복속도를 측정함으로써 간접적으로 결정하였다.결과: NHE1,2,3 모두 사람 정상 중이점막 상피세포에서 발현되었다. PH의 회복속도는 HOE694 50 M 이상의 농도에서 NHE2와 NHE3의 기능저하로 인해 억제되었다. 650 M의 HOE694와 S3226으로 NHE3를 억압하였을 경우 삼출액 흡수속도가 의미 있게 감소되었다. Dexamethasone은 NHE3의 발현을 농도에 비례하여 증가시켰다. 삼출액 흡수속도는 Dexamethasone처리에 의해서 증가되었고 NHE3의 억제에 의해서 감소되었다.결론: 본 논문에서는 NHE3가 사람 정상 중이점막 상피세포에서 pH와 삼출액 흡수에 모두 작용한다는 것을 증명하였다. Dexamethasone은 사람 정상 중이점막 상피세포에서 NHE3의 발현을 증가시키고 NHE3에 의한 삼출액흡수를 증가시킨다. 이러한 결과는 삼출성 중이염에서 임상적으로 흔히 사용해 왔던 스테로이드 치료에 관한 치료 기전에 이론적 바탕이 될 수 있으며 기도 상피세포의 점액 조절에 관한 여러 기전 중에서 새로운 발견이라 할 수 있다.

[영문]Background: The proper homeostasis of the liquid lining the surface of the middle ear cavity is vitally important for maintaining a fluid-free middle ear cavity. Disruption of this homeostasis leads to fluid collection in the middle ear cavity and results in otitis media with effusion (OME).Purpose: The purpose of this study was to investigate the molecular and functional expression of the Na+/H+ exchanger (NHE)s in normal human middle ear epithelial (NHMEE) cells and to evaluate the role of NHEs in fluid absorption and the effect of dexamethasone (DXM) on NHE function and NHE-dependent fluid absorption in NHMEE cells.Materials and Methods: Western blot analysis was performed for NHE1, -2, and -3 in NHMEE cells. The fluid absorption rate was measured after liquid application on the luminal surface of the cells. Intracellular pH (pHi) was measured using the pH-sensitive fluorescent probe bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF)-AM. NHE activity was determined as Na+-induced pHi recovery from an acid load achieved by luminal exposure to 40 mmol/l NH4Cl.Results: NHE1, -2 and -3 were all expressed in the NHMEE cells. The pHi recovery rate was suppressed by inhibition of NHE 2 and -3 with HOE694 at concentrations greater than 50 M. Inhibition of NHE3 with 650 M of HOE694 or S3226 significantly decreased the fluid absorption rate. Dexamethasone increased the Na+-induced pHi recovery rate which was reversed by the inhibition of NHE-3 with 650 M of HOE694. Dexamethasone treatment up-regulated NHE3 expression in a dose-dependant manner. The fluid absorption rate was increased by treatment with Dexamethasone (10-7 M) and reversed by the inhibition of NHE3.Conclussion: This study have shown that NHE3 are involved in the regulation of both pHi and fluid absorption on the luminal surface of NHMEE cells. Dexamethasone stimulates NHE3 expression and NHE3-dependent fluid absorption in NHMEE cells. These findings provide a new insight into mechanisms that regulate periciliary fluid and the therapeutic mechanisms behind steroid treatment of otitis media with effusion.