주골반 자율신경절 세포에서 Tyrosine kinase에 의한 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 조절

Abstract

[한글]단백질 인산화(protein phosphorylation)는 전사 후 주요 단백질 구조변경(major posttranslational modification) 기전으로 거의 모든 세포내 생리적 과정을 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 단백질 kinase 유전자는 500여개로 전체 인간 유전자의 약 2%를 차지하며, 이 중 약 20%가 tyrosine kinases(protein tyrosine kinases, PTKs)에 해당된다. PTK 과(family)는 수용체 tyrosine kinases(receptor PTKs)와 비수용체 tyrosine kinases(non-receptor PTKs)로 구분되며, PTKs의 인산화는 많은 종류의 세포에서 성장(cell growth), 분화(differentiation), 증식(proliferation), 생존(survival), 자멸사(apoptosis) 등과 관련된 다양한 신호전달 경로에 중요한 기능을 한다. 최근에는 PTKs가 이온채널의 조절에도 영향을 주는 것으로 밝혀지면서 신경조직에 광범위하게 발현되어 있는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR)의 조절기전에 PTKs가 어떤 방식으로 관여하는지에 대한 연구가 이루어지고 있다. 그러나 지금까지는 주로 중추신경계에서의 조절특성에 관한 보고가 대부분으로 자율신경계와의 관련성에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 첫째, 수컷 쥐의 주골반 신경절(major pelvic ganglia, MPG) 세포에 발현되어 있는 nAChR의 기능적 특성을 확인하고, 둘째, nAChR의 활성 조절기전 중 하나로 PTKs가 관여하는지를 규명하고자 하였다. 이를 위하여 전기생리학적 방법인 전세포 패치 클램프(whole cell patch clamp), 형광을 이용한 세포내 칼슘 측정, 분자생물학적 동정, tyrosine kinase 활성도 측정 등과 같은 실험방법을 이용하였으며, 본 연구의 주요 실험결과는 다음과 같다.쥐의 주골반 신경절 세포에서 아세틸콜린에 의한 내향성 전류는 α3β4 nAChR의 선택적 봉쇄제인 α-conotoxin AuIB(10 μM)에 의해 80% 이상 억제되었으며 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타나(IC50; 1.41±0.14 μM), 쥐의 주골반 신경세포에는 주로 α3β4 서브유닛의 조합으로 이루어진 nAChR가 발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 세포외 Ca2+과 Na+을 제거한 상태에서의 아세틸콜린 투여에 의한 내향성 전류와 [Ca2+]i의 증가는 약 90% 정도 억제되는 것으로 보아 α3β4 nAChR를 통해서는 세포밖 Ca2+과 Na+이 유입되는 것으로 보인다. 아세틸콜린 투여시 유발된 전류와 세포내 칼슘이온 농도의 증가는 광범위 PTK 억제제인 genistein(10 μM)을 3분간 전 처치하였을 때 크게 감소하였다. 그러나 비활성 형태의 유사체인 genistin(10 μM)을 투여하였을 경우에는 변화가 나타나지 않았다. 또한 PTKs 의 한 그룹인 Src family kinases(SFKs)의 선택적 억제제인 PP2(5 μM)를 3분 동안 전처치 하였을 때 내향성 전류와 세포내 칼슘이온 농도가 의미있게 감소하였으나 비활성 형태인 PP3(5 μM) 투여시에는 효과가 없었다. 반면에 PTP(protein tyrosine phosphatase) 억제제인 sodium orthovanadate(200 μM)를 전극내 용액(internal solution에 첨가하여 세포내로 투여하면서 3분, 6분, 9분, 12분 되는 시점에서 아세틸콜린을 투여하였을 때 전류의 크기가 점차로 증가하였다. 한편, tyrosine kinase assay 결과에서는 PP2에 의해 선택적으로 PTK의 활성도가 감소하는 것으로 나타났으며, 역전사 중합 연쇄반응 분석으로 주골반 세포에는 SFKs 중 Src-2 kinase의 mRNA가 발현되어 있음을 확인하였다.이상의 결과들로부터 수컷 쥐의 주골반 신경절 세포에 발현되어 있는 α3β4 nAChR는 Src-2 kinase를 통한 tyrosine 인산화에 의해 양성적으로(positively) 조절되고 있음을 알 수 있었다.

[영문]It is widely known that protein tyrosine kinases(PTKs) are involved in controlling many biological processes such as cell growth, differentiation, proliferation, survival and apoptosis. Recently it has been reported that the activity of acetylcholine receptors(AChRs) in some neurons can be regulated by PTKs. In particular, Src family kinases(SFKs), one of the groups of tyrosine kinases, regulate the activities of a variety of neuronal channels including AChRs, which are expressed ubiquitously in many cell types but are especially abundant in neuronal tissues. An α3β4 subunit combination acts as a major functional acetylcholine receptor(nAChRs) in male rat major pelvic ganglion(MPG) neurons, and their activation induces fast inward currents and intracellular calcium increases. The exact mechanism of regulation of nAChRs by PTKs is poorly understood. Therefore, we examined the role of phosphorylation by PTKs using electrophysiology, calcium imaging, RT-PCR technique and kinase assays in MPG neurons.ACh induced inward currents and [Ca2+]i increases in MPG neurons, concomitantly. These responses were inhibited by more than 90% in Na+- or Ca2+- free solution. α-conotoxin AuIB, a selective α3β4 nAChR blocker, inhibited ACh-induced inward current in a concentration-dependent manner(IC50 =1.41±0.14 μM, n=8). Genistein (10 μM), a broad-spectrum tyrosine kinase inhibitor, markedly decreased ACh-induced currents and Ca2+ transients, whereas 10 μM genistin, an inactive analogue, had little effect. PP2(5 μM),a selective Src-kinase inhibitor, attenuated the ACh-induced peak currents and [Ca2+]i in MPG neurons, whereas PP3, an inactive analogue, had no effect. On the contrary, ACh-induced inward currents were significantly augmented with an inclusion of sodium orthovanadate (200 μM), a tyrosine phosphatase inhibitor. In the tyrosine kinase assay, PTK activity was also significantly inhibited by treatment with 10 μM PP2(p<.01), but not by PP3. RT-PCR analysis showed that, among families of Src kinases, Src-2 kinase was expressed in high amounts in MPG neurons. Overall these data suggest that the activities of α3β4 AChRs are positively regulated by PTK, particular in Src-2 kinase in MPG neurons.In conclusion, Src-2 kinase may be one of the key factors in the regulation of α3β4 nAChRs in rat MPG neurons, which may play an important roles in the autonomic neuronal function such as synaptic transmission, autonomic reflex, and neuronal plasticity.