Functional enhancement of dendritic cells by biological response modifiers in tumor immunity

Abstract

[한글]치명적인 췌장암을 극복하기 위한 일련의 노력으로 인체 면역시스템을 치료에 응용한 항암면역요법(cancer immunotherapy)이 새로운 치료법으로 주목 받고 있다. 본 연구는 (1) 강력한 항원제시세포(antigen-presenting cell)인 수지상 세포(dendritic cell, DC)에 췌장암의 heat-treated tumor lysate(HTL)를 도입하여 췌장암 동물모델에서의 항암효과를 증명하고, 인간 말초 혈액 내 단핵구(monocyte)로부터 수지상 세포를 체외 배양하는 과정에서 (2) flt3-ligand(FL) 또는 (3) 다양한 cytokine 및 Toll-like receptor(TLR) ligands의 조합을 이용하여 보다 많은 수의, 보다 강력한 수지상 세포를 만들어보고자 하였다.(1) 췌장암 마우스 모델에서의 수지상 세포의 HTL 도입 실험 요약: 본 연구는 DC의 종양 항원(tumor antigen) 인식 단계에서 기존에 사용되는 tumor lysate(TL) 대신 HTL을 새롭게 시도하여, 열에 의해 유도된 열충격단백질(heat shock protein, HSP)이 종양 항원을 다양하게, 보호된(chaperoned) 형태로 전달함으로써 췌장암의 종양 면역원성(tumor immunogenicity)을 증가시키는지를 검증하고자 하였다. C57BL/6 마우스에서 PANC02 세포주를 주입하여 종양을 형성한 후, DC를 주입하여 일정기간 종양의 크기를 재고 각종 면역세포의 동향을 추적 실험하였다. DC는 마우스의 골수세포로부터 분화시켜 unpulsed DC, TL-DC, HTL-DC로 나누어 PANC02 종양 항원을 도입한 후 완전 성숙시킨(full maturation) 상태에서 종양을 발현한 마우스에 1주 간격으로 총 3번 피하주사하였다. Western 분석 결과, 42℃ 2시간의 열처리에 의해 주요 기능을 하는 HSP70, HSP90이 증가함을 확인하였다. HTL-DC, TL-DC, DC 순서로 종양의 성장이 억제되었고 (생리식염수를 투여한 대조군의 평균종양부피를 100%로 산정하였을 때 HTL-DC는 56%, TL-DC는 74%, DC는 88% 수준), 이와 같은 경향은 활성화된 T 세포에서 분비되는 IFNγ의 ELISPOT assay 및 PANC02를 표적 세포로서 시행한 세포독성시험(cytotoxicity assay)을 통해서도 재확인되었다.(2) Flt3 ligand (FL)의 인간 말초 혈액의 단핵구(monocyte)에의 영향 실험 요약: FL은 tyrosine kinase receptor인 Flt3 (CD135)에 특이적으로 결합하는 조혈성장인자로서 임상에서는 항암 치료 및 골수 이식에 있어서 줄기 세포, 원시 세포(progenitor cell) 및 수지상 세포를 말초 혈액으로 구동화(mobilization) 시키는 데 사용되고 있다. FL이 수용체에 결합한 이후의 생리학적 현상들이 일부 알려져 있음에도 불구하고 말초 혈액내 단핵구에 발현하는 Flt3에 결합 가능한 FL의 생리적 기능은 아직 명료하게 밝혀지지 않았다. 부착성(adherence) 또는 MACS를 이용하여 분리한 CD14+ 단핵구에 FL을 함께 배양하여 단핵구의 증식(proliferation) 또는 세포 사멸(apoptosis)에 어떤 영향을 미치는지, 이는 어떤 세포 신호 전달 과정을 거치는지 실험하였다. 그 결과, FL은 용량 의존적인 경향을 가지고 단핵구의 증식을 유도하였으며, 아울러 단핵구의 자연적인 세포 사멸을 억제할 수도 있음을 밝혀내었다. 또한 FL은 ERK 인산화를 경유하여 증식 작용을 나타내는 것으로 보이며 이는 ERK 억제제에 의하여 그 효과가 상쇄됨이 증명되었다. 반면 p38 MAPK, JNK, 및 Akt는 상대적으로 미미한 영향을 미치는 것으로 나타났다.(3) 다양한 cytokine 및 TLR ligand를 이용한 단핵구 유래 수지상 세포(monocyte-derived DCs)에의 영향 실험 요약: 수지상 세포의 항암 백신 연구가 진행되면서 말초 혈액 단핵구 유래의 수지상 세포의 체외 배양(in vitro culture)에 있어서 생체 활성 물질을 이용한 maturation 실험 또한 관심이 집중되고 있다. 기존에 체외 배양에서 사용하는 LPS는 그 자체가 발열원(pyrogen)이 되어 septic shock을 일으킬 수 있으므로, 본 실험에서는 기존 연구에서 수지상 세포의 기능에 긍정적인 영향을 주는 것으로 알려진 몇 가지 cytokine과 TLR ligand를 단독 또는 병용 투여하여 LPS와 같은 독성작용 없이 수지상 세포의 기능을 증진시킬 수 있는지 시험하였다. Cytokine으로는 CD40L, IFNγ, TNFα를 사용하였고, TLR ligand로는 polyI:C, MPL을 사용하였으며, 수지상 세포의 활성은 유세포 분석(FACS), 배양액(cell culture supernatant) 내 IL-12p70및 IL-10의 ELISA 측정, MLR을 통하여 확인하였다. 그 결과, cytokine간의 배합에서는 CD40L+IFNγ 병용시 CD83의 발현 및 IL-12p70 분비능이 우수하였으며, cytokine+TLR ligand의 배합에서는 IFNγ+polyI:C, CD40L+polyI:C의 병용 처리시 수지상 세포의 성숙 인자 발현, IL-12p70의 분비능, T세포 자극능이 우수한 것으로 나타났다. 특히 IFNγ+polyI:C의 경우, IFNγ에 의해 polyI:C의 면역억제성 (immunosuppressive) cytokine인 IL-10의 분비능이 감소되는 장점도 관찰할 수 있었다. TLR ligand간의 병용투여는 유세포 분석 결과 maturation에 유리하지 않았으며 오히려 IL-10의 분비만 증가시킴으로써 후보군에서 배제되었다.이상에서 보는 바와 같이, 본 연구는 수지상 세포를 이용한 항암 면역 요법에 있어서 항원 도입 단계에서의 HTL, 수지상 세포의 초기 배양 단계에서의 FL, 미성숙 수지상 세포의 성숙 인자로서 cytokine 및 TLR ligand를 생체 활성 물질(biological response modifier)로서 설정하여 각각에 적합한 기능 분석을 수행하여 실제로 수지상 세포의 기능 증진에 기여할 수 있는지를 확인하고자 하였다. 그 결과, 췌장암 마우스 모델을 이용한 수지상 세포 기반의 면역요법에서 종양항원으로써 HTL이 기존의 TL보다 우월한 효능을 보여 실제 췌장암 환자를 대상으로 항암면역요법에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대되며, 인간 단핵구 유래의 수지상 세포 배양에 있어서 기존에 사용하던 GM-CSF 및 IL-4 외에 FL을 첨가하여 배양할 경우 보다 강력하고 높은 회수율(yield)의 수지상 세포를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한 CD40L, IFNγ, TNFα, MPL, polyI:C 등과 같이 기존에 수지상 세포에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 물질들을 단독 또는 병용 처리하여 수지상 세포의 기능을 다양한 각도로 분석하는 시도를 통해, 수지상 세포 기반의 항암 면역 요법의 프로토콜 확립에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

[영문]Part I: Cancer vaccines using dendritic cells (DCs) have been shown to induce antitumor immunity and have recently been applied to non-immunogenic cancers, such as pancreatic cancer. In this study, DCs loaded with heat-treated tumor lysate (HTL-DC) were utilized as a vaccine in order to stimulate antitumor immunity in a murine pancreatic cancer model and compared them to DCs loaded with tumor lysate (TL-DC). The poorly immunogenic mouse ductal pancreatic cancer cell line PANC02 with syngeneic mouse strain C57BL/6 was used as a model. Inducible heat shock proteins (HSPs) were significantly increased in HTL (HSP70 and HSP90). Tumor size measurements indicated that HTL-DC induced stronger tumor suppression than unpulsed DC or TL-DC (43% reduction in tumor volume compared to control group). T cell proliferation assay and IFN？ ELISPOT assay showed that T cell activation increased in the following order: DC < TL-DC < HTL-DC. Furthermore, repeated HTL-DC vaccinations led to higher expansion of IFN？-secreting T cells. Cytotoxicity assay revealed that HTL-DC were more efficient in priming PANC02-specific T cells. The present study identifies HTL as an effective source of tumor-associated antigens (TAAs) for pulsing DCs, and demonstrates that HTL-DC can generate a stronger and broader T cell response against fatal cancers, such as pancreatic cancer.Part II: Flt-3 ligand (FL), a hematopoietic growth factor, plays a pivotal role in development and activation of dendritic cells (DC), NK cells (NK), T cells, and B cells. Although some post-receptor signaling events of FL have been characterized, the role of FL on flt3 expressing peripheral blood monocyte is unclear. In the current study, the role of FL on cell growth and survival of peripheral blood monocytes was examined. It was elucidated that FL promoted dose-dependent monocyte cell growth and prevented spontaneous apoptosis of monocytes. FL induced ERK phosphorylation and a specific ERK inhibitor PD98059 completely inhibited the FL-mediated monocyte proliferation, while p38 MAPK, JNK, Akt were relatively not affected. In consideration of clinical importance, the yield of DC in vitro from adherent cells or purified CD14+ cells that are capable of proliferation after exposure to FL expanded beyond the number of starting monocytes. Thus, the use of FL might be an important method to generate larger number of DC. These results suggest that monocytes represent circulating precursors of DCs and could have important implications for the design of future immunotherapeutic strategies utilized DCs.Part III: Monocyte-derived dendritic cells (DCs) in clinical use for tumor immunotherapy are ideally generated with inclusion of proper maturation factor at the end of the incubation. Single or binary combination of cytokines [CD40 ligand (CD40L), interferon (IFN) ？^, tumor-necrosis factor (TNF) ？\] and toll-like receptor (TLR) ligands [monophosphoryl lipid A (MPL), polyriboinosinic: polyribocytidylic acid (polyI:C)] were compared with LPS. DCs stimulated with various combinations of cytokines and TLR ligands for 2 days were assessed by immunophenotyping, cytokine ELISA (IL-12p70 and IL-10), and allogeneic T cell proliferation assay. With the exception of single use of polyI:C, DCs stimulated with CD40L+IFN？^ induced high levels of IL-12p70 secretion. High levels of IL-10 were induced by two TLR-mediated stimuli, polyI:C and MPL. When T cell responses compared in allogeneic mixed leukocyte reaction, DCs stimulated with IFN？^+polyI:C, CD40L+polyI:C, or polyI:C alone induced higher T cell proliferation than DCs stimulated with LPS. In the presence of IFN？^, IL-10 production of DCs were decreased. Thus, monocyte-derived DCs stimulated with IFN？^+polyI:C efficiently induced T cell proliferation by secreting IL-12p70 and increasing expression of CD83 and CD86. From these results, a better understanding of DC maturation and the function of the differently matured DCs to induce immune responses will be considerably beneficial for developing DC-based immunotherapeutic strategies.