결핵균 30kDa 항원 자극에 의한 대식세포의 NF-kB 활성화와 cytokine생성 유도에서 Toll-like receptor 2의 역할

Abstract

[한글]결핵균은 세포 내 기생세균으로 숙주의 대식세포에 의해서 파괴되지 않고 만성감염을 유발한다. 즉 흡입에 의해서 체내로 들어가 폐에서 대식세포에 탐식된 후 생존, 증식하여서 결국 폐에 감염원을 생성하기 때문에 대식세포의 반응을 연구하는 것이 결핵균에 대한 면역반응을 이해하는데 몹시 중요하다. 대식세포는 선천면역반응에 우선 관여하는데 대식세포의 수용체 중 Toll-like receptor(TLR)는 미생물에서 존재하는 PAMP(pattern-recognition molecular pattern)를 인지하여 병원체와 자신을 구별한다. TLR ligand 중 특히 그람 음성균 박테리아의 세포벽 성분의 lipopolysaccharide(LPS)와 그람 양성균의 lipoteichoic acid(LTA)가 대표적인 PAMP로서 각각 TLR2와 TLR4와 반응한다. 결핵균 항원도 TLR을 통하여 면역세포를 활성화시킨다는 보고가 있지만 현재까지 TLR과 연관된 연구는 결핵균 다당류 항원 (예; lipoarabinomannan)으로 제한되어 있었다. 그러므로 본 연구에서는 결핵균 단백 항원 중에서 TLR을 자극하는 항원이 있는지를 사람 대식세포주와 TLR2/4 transfectant cell에서 관찰하였다.본 실험에서는 총 9종류의 결핵균 단백항원을 사용하였다. 10, 22, 30, 38 kDa 항원은 정제된 항원이며, 6, 16, 19, 38, Ag85A는 재조합항원이었다. 사람 대식세포주인 THP-1 세포를 대상으로 TLR분자의 발현과 cytokine 생성의 변화를 확인하였을 때, 재조합항원에서는 19kDa 을 제외한 6, 16, 38, Ag85A 항원은 cytokine 생성을 강하게 유도하였다. 또한 정제항원 중에서는 30kDa 항원이 대식세포에서 TNF-α와 IL-6의 생성을 가장 강하게 유도하였다. 이상 9종류의 항원 중 단백 생성 과정에서 포함된 LPS에 의한 영향을 배제하기 위하여 정제항원만을 중심으로 이후 연구를 진행하였다.MAP kinase 활성화를 관찰한 결과 정제 30kDa항원은 ERK의 활성화를 강하게 유도하였고, 정제 30kDa 항원이 대식세포를 자극하는 기전을 파악하기 위하여 TLR2 또는 TLR4 transfectant HEK293 세포를 대상으로 NF-κB 활성화를 측정하였다. 그 결과 정제 30kDa 항원 자극에 의하여 TLR2 transfectant cell에서만 NF-κB 활성화가 강하게 관찰되었고 TLR4 transfectant cell에서는 관찰되지 않았다. TLR2 transfectant cell에서 유도된 NF-κB 활성화는 항-TLR2 항체에 의하여 억제되었다.이상의 결과를 통하여 결핵균 30kDa 항원이 TLR2를 자극함으로써 대식세포의 활성화를 유도하여 IL-6 및 TNF-α를 생성시키는 것으로 추정되었다. 본 연구에서는 결핵균 단백항원 중에서도 TLR2와 반응하는 분자가 있음을 밝혔으며 이는 30kDa 항원이 결핵균 감염 시 인체의 면역반응을 조절할 가능성을 제시한다.

[영문]Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, is an intracellular bacterium that is capable of surviving and persisting within host mononuclear cells. Macrophage phagocytosis of M. tuberculosis bacilli is accompanied by activation of the transcription factor NF-κB, secretion of inflammatory mediators, release of the reactive nitrogen intermediate NO, and secretion of several chemokines. Mammalian Toll-like receptor (TLR) proteins have recently been shown to play important roles in host cell response to bacteria and bacterial products in vitro. Mycobacterial products released as PIM, LM, LAM, lipoproteins and other mycobacterial factors may contribute to continued macrophage and dendritic cell(DC) activation through PRR such as TLRs and others. Several published reports have shown that the TLR2 and TLR4 proteins mediate cellular activation by a variety of bacterial products, including gram-negative bacterial lipopolysaccharide(LPS), the mycobacterial glycolipid lipoarabinomannan(LAM), bacteraial lipoproteins, peptidoglycan and zymosan. Up to the present, several mycobacterial antigens can achieve cellular activation through interaction with TLR2.In this study, we used several mycobacterial antigens(purified 10, 22, 30, 38kDa, recombinant 6, 16, 19, 38kDa and Ag85A antigen). The characteristics of the human macrophage cell line THP-1 was investigated solely by stimulation with purified antigen in order to prevent LPS contamination of recombinant antigen in the process of protein synthesis. Purified mycobacterial antigen-induced TLR expression and cytokine production in human PMA-differentiated THP-1 macrophage cells, even without treatment with mycobacterial antigens, increased levels of TLR2 and TLR4 expression. We obtained evidence demonstrating that only 30 kDa antigen induces production of IL-6 or TNF-alpha in THP-1 macrophages cells.We examined the influence of mycobacterial purified antigens on the MAP kinase signaling pathway in THP-1 cells and HEK293-TLR2/4 transfectant cells. When THP-1 cells were treated with 30kDa antigen, strong phosphorylation of ERK occurred. We also found that the 30kDa antigen activated NF-kB in TLR2-transfected cells, not TLR4-transfected cells. Antibody blocking experiments revealed that the inhibition of anti-TLR2 to NF-κB activation in TLR2-transfactant cells.These results indicate that TLR2 may act as an important receptor when stimulated with 30kDa antigen in macrophage infection.