Regulation of FBI-1 Activity by sumoylation

Abstract

[한글]FBI-1(Factor that Binds to Inducer of Short Transcripts)은 HIV-1(human immunodeficiency virus, type 1) LTR 프로모터의 IST(inducer of short transcripts) element에 결합하여 전사를 조절하며 N-말단에 POZ 도메인과 C-말단에 4개의 Kr?ppel-like zinc finger를 갖는 단백질이다. 이미 알려진 대로 ADH5/FDH 프로모터와 HIV-1 LTR 프로모터에서 전사를 조절하는 역할 뿐만 아니라 지방세포로의 분화와 골세포 형성과정에도 관여하는 것으로 밝혀져 세포의 발달과 분화 과정에도 작용함을 알 수 있다.

SUMO (small ubiquitin-related modifier)는 ubiquitin과 18%의 낮은 아미노산 서열 유사성을 갖지만, 단백질 3차 구조가 거의 유사하며 target 단백질의 동일한 lysine 잔기를 인식한다. 하지만 ubiquitin과는 다르게 proteasome에 의한 proteolytic protein degradation을 유도하지 않으며 translation의 조절과 세포 내 단백질의 이동에 영향을 미친다. 일반적으로 ubiquitin이 전사 수준에서 유전자 발현을 증가시키는 경향이 있는 반면에 SUMO는 전사를 감소시키는 경향을 보인다.

최근 많은 전사인자들의 sumoylation 이 보고되고 있다. 연구된 바에 따르면 절반이 넘는 SUMO의 target 단백질이 transcription co-activator와 co-repressor이고 대부분의 경우, SUMO가 전사억제를 유도하는 것으로 밝혀졌다.

우리는 FBI-1과 동일하게 POZ 도메인과 zinc finger DNA 결합 부위를 갖는 전사 조절 인자인 PLZF가 sumoylation된다는 사실을 바탕으로 FBI-1의 sumoylation 가능성을 예상, FBI-1에 consensus motif의 존재여부를 확인해보았다. 그 결과, 10개의 sumoylation 가능성이 있는 lysine 잔기가 존재함을 발견했다.

우리는 Sumoylation assay를 통해, FBI-1이 SUMO-1과의 공유결합에 의해 wild type의 FBI-1보다 더 큰 band가 생성되는 결과를 통해, FBI-1이 in vitro에서 sumoylation 됨을 확인하였다. 또한 SUMO가 결합하지 못하도록 만든 mutant가 FBI-1의 전사 억제 작용에 미치는 영향을 알아보기 위하여 FBI-1이 전사억제자로 작용하는 것으로 알려진 ADH5 minimal 프로모터에서 mutant의 효과를 알아보았다. ADH5 프로모터의 존재 하에 FBI-1을 처리하였을 경우 잘 알려진 바와 마찬가지로 전사가 80%이상 억제되는 것을 볼 수 있다. FBI-1의 lysine 잔기를 arginine으로 각각 치환한 mutant (K61R, K383R, K371R, K379R, K383R, K486R, K497R, K536R, K539R)를 처리한 경우 FBI-1의 repression 효과가 조금씩 유의성 있게 감소됨을 보였다. 특히 K379R, K396R, K536R, K539R mutant의 경우 wild type의 FBI-1 보다 2배 이상 repression 효과를 감소시켰다. 이러한 sumoylation에 의한 효과는 FRE에 결합하여 전사를 증가시킨 FBI-1의 전사활성 기능을 억제시킴으로써 확인되었다. 이 결과들을 통해, 우리는 FBI-1이 SUMO-1과 결합하며 SUMO-1에 의해 전사조절능력에 영향을 받는다는 사실을 발견하였다.

[영문]FBI-1 is a transcription regulator with POZ domain at N-terminus and four Kruppel-like zinc fingers at C-terminus. It regulates transcription of the ADH5/FDH promoter and HIV-1 LTR promoter. Recently, it was suggested that it plays important role in adipogenesis, osteogenesis, oncogenesis, and transcription of NF-kB responsive genes.

Sumoylation modulates cellular functions of many proteins by influencing the activity of transcription regulators, subcellular localization, and stability. Unlike ubiquitination, sumoylation does not lead to protein degradation by proteasome. In general, SUMO seems to decrease transcription while ubiquitin increases transcription. The sumoylation of many transcription factors are reported recently.

We investigated whether FBI-1 could be post-translationally modified by sumoylation and the modification could affect the transcription properties of FBI-1. Upon careful analysis of amino acid sequence of FBI-1, we found 10 potential sumoylation sites located at lysine 61, 354, 371, 379, 383, 396, 486, 487, 536 and 539. We mutated each these amino acids into arginine and tested whether the mutant FBI-1 could affect the transcription properties of FBI-1 on the FBI-1 responsive gene, such as ADH5/FDH. Wild type of FBI-1 potently represses transcription of ADH5/FDH, but some mutants were much weaker transcription repressors (more than 2.2 fold to 3.3 fold than wild type, respectably mutants K379R, K396R, K536R, and K539R). And other mutants also showed weak repression than wild type (more than 1.3 fold to 1.8 fold than wild type). It suggests that sumolyation might be important in transcription repression by FBI-1.

We also found that FBI-1 is sumoylated in vivo and FBI-1 activity as transcription factor may be regulated by sumoylation in vivo.